DNA Methylation Clock Analysis and Comparison in Korean with Type 2 Diabetes

Abstract

Background: Diabetes mellitus, a chronic disease whose prevalence is increasing worldwide, is important to manage because it causes systemic and complex complications. It is also known that the prevalence of diabetes tends to increase with age, and age-related diseases appear earlier in diabetic patients. Among them, type 2 diabetes is an important type of diabetes, accounting for 90% of all diabetes patients. On the other hand, DNA methylation is an emerging tool for studying the epigenetic aging mechanism. It is known to play an essential role in developing various diseases because it reflects the effects of the individual's environment and lifestyle and causes changes in gene expression. In addition, it can function as a clinically and epidemiologically important biomarker because it is stable, has low invasiveness, and is reversible. Estimating age according to DNA methylated loci is called DNA methylation age (mAge), also called epigenetic biomarker of aging. The basic principle is to select hypermethylated or hypomethylated CpGs based on various health risks related to aging, such as cancer, obesity, and cardiovascular disease, and measure aging linearly through this. The modeling calculating the methylation age is called a DNA methylation clock, or a methylation clock. Meanwhile, DNA methylation clock tends to be underestimated in those aged 60-65 years and older. Furthermore, it lacks ethnic diversity, especially in Asians, so the tendency to underestimate the methylation age in the Korean diabetic cohort or the relationship between diabetes-related factors and methylation age was not confirmed yet. Therefore, in order to find out the relationship between Koreans with type 2 diabetes and aging through the correlation between methylation age and the Korean diabetic cohort, this study investigated a relationship among nine DNA methylation clocks (Horvath, Hannum, PhenoAge, GrimAge, AAHorvath, AAHannum, AAPheno, AAGrim, and DunedinPACE), and part of the Seoul National University Hospital T2D cohort (SNUH), and part of the Ansan/Anseong Community-based Cohort (AS) of the Korean Genome and Epidemiology Study (KoGES). Methods: The SNUH cohort consisted of 429 patients (232 patients with type 2 diabetes and 197 patients in the control group), and the AS cohort consisted of 400 patients (200 patients with type 2 diabetes and 200 patients in the control group). After receiving the raw DNA methylation data of the two groups, the methylation density was calculated as a beta value, from which the methylation age and acceleration were obtained. In addition, according to diabetes status, duration of diabetes, and stage of CKD, groups were divided as follows: diabetes group/control group, long duration group (more than 10 years)/short duration group (less than 10 years)/non-diabetic group, and CKD stage 5/CKD stage 4/CKD stage 3 or less with type 2 diabetes groups. Each groups methylation age and acceleration were plotted according to age, and the mean and variance were compared. By applying a multiple linear regression equation, it was confirmed that the clock significantly reflects fasting glucose, an index reflecting the results of diabetes and the primary criterion for diagnosing diabetes. In addition, the AICs of the multiple linear regression models for each clock in the entire cohort were compared. Through a Bland-Altman plot, it was confirmed that the Korean diabetic cohort also shows underestimation tendency of DNA methylation clocks. In addition, it was confirmed whether CpGs known to be related to type 2 diabetes were included in the clocks used in this study. Among those CpGs, CpGs that showed significant differences between groups in this study were summarized. Results: As a result of applying nine epigenetic clocks in the Korean diabetic cohort and examining them in various ways, the clocks in which diabetes status and progression of CKD stage in diabetic patients were reflected in aging were Horvath mAge/EAA, Hannum mAge/EAA, and DunedinPACE. In addition, in the group with more patients with accelerated aging due to aggravated progression of T2D, the glucose variable in the multiple linear regression model appeared significantly, and the underestimation tendency was prominent. The above indicated an association between the Korean diabetic cohort and mAge/EAA. Therefore, this study provides a basis for using mAge/EAA to study aging and complications in Korean diabetic patients. On the other hand, it was found that T2D-related CpGs with significant differences between the subgroups in the Korean diabetic cohort were not included more than 10 in the clocks. Therefore, to study aging and complications in Korean with T2D, we propose to create a next-generation clock that includes them. However, since the two cohorts differ in the composition of diabetes severity and the whole sample size is small, follow-up studies are needed to support this result. If a large sample size is obtained, it is proposed to conduct a study to see the difference in absolute values as well as the difference in slope in the plot of mAges/EAAs by fixing the age of the diabetic group and the control group equally.

세계적으로 유병률이 증가하고 있는 만성질환인 당뇨병은 전신적이고 복합적인 합병증을 유발하므로 관리가 중요한 질환이다. 또 당뇨병은 나이가 들수록 유병률이 증가하는 경향성이 있고, 당뇨병 환자에서는 연령 관련 질환들이 일찍 나타나는 것으로 알려져 있다. 그중에서도 제2형 당뇨병은 전체 당뇨병 환자의 90%를 차지할 만큼 중요한 당뇨병 유형이다. 한편 후생유전학적 노화의 메커니즘을 연구하는 데에 있어 DNA 메틸레이션은 떠오르는 도구로, 개체의 환경 및 생활습관의 영향이 반영되고 유전자 발현에 변화를 일으키기 때문에 다양한 질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또 안정적이고 침습성이 낮으며 가역적이라는 특성이 있어 임상적, 역학적으로 중요한 바이오마커로 기능할 수 있다. DNA 메틸화가 된 CpG의 위치와 정도에 따라 연령을 추산하는 것을 DNA 메틸레이션 연령이라고 부르고, 이것은 후성유전학적 노화 바이오마커라고도 부른다. 기본 원리는 암, 비만, 심혈관 질환 등 노화와 관련된 다양한 건강 위험들을 기준으로 과메틸화 또는 과소메틸화된 CpG를 선정하고 이를 통해 선형적으로 노화를 측정하는 것이며, 이렇게 메틸레이션 연령을 산출하는 모델링을 메틸레이션 시계라고 부른다. 한편 메틸레이션 시계는 60-65세 이상에서 과소평가되는 경향성이 있고, 특히 아시아인에서 민족 다양성이 부족하여, 한국인 당뇨병 코호트에서 메틸레이션 연령의 과소평가 경향성이나 당뇨 관련 요인들과 메틸레이션 연령의 관련성은 확인되지 않았다. 따라서 메틸레이션 연령과 한국인 당뇨병 코호트와의 상관관계를 통해 제2형 당뇨병을 가진 한국인과 노화의 관계를 알아보기 위해, 본 연구는 메틸레이션 연령 및 가속도를 계산하는 메틸레이션 시계 9가지(Horvath, Hannum, PhenoAge, GrimAge, AAHorvath, AAHannum, AAPheno, AAGrim, and DunedinPACE)와 서울대학교병원 인체자원은행 당뇨병 클리닉 코호트의 일부(SNUH), 질병관리청 한국인유전체역학조사사업 KoGES의 안산/안성 지역사회 기반 코호트의 일부(AS)의 관계를 살펴보았다. SNUH 코호트는 제2형 당뇨병 환자 232명, 대조군 197명 총 429명으로 구성되었으며, AS 코호트는 제2형 당뇨병 환자 200명, 대조군 200명 총 400명으로 구성되었다. 두 그룹의 DNA 메틸레이션 원시 데이터를 받아 메틸레이션 밀도를 베타 값으로 계산하고, 이로부터 메틸레이션 연령과 가속도를 구했다. 또 두 그룹의 당뇨 여부, 당뇨 유병 기간, CKD 기수에 따라 각각 당뇨군/대조군, 유병 기간 긴 군(10년 초과)/짧은 군(10년 이하)/비당뇨군, CKD 5기/CKD 4기/CKD 3기 이하의 당뇨군으로 하위군을 나누어 각 군의 메틸레이션 연령과 가속도를 연령에 따라 그래프를 그리고, 평균과 분산을 비교했다. 또 다중선형회귀식을 적용해 당뇨병의 결과가 반영되는 지표이자 당뇨병 진단의 1차적 기준이 되는 공복 혈당을 유의하게 반영하는 시계를 확인했다. 또 전체 코호트에서 각 시계별 다중선형회귀식 모델의 AIC를 비교하였다. 메틸레이션 연령이 고령자에서는 과소평가되는 경향성이 알려져 있는데, 이것이 한국인 당뇨병 코호트에서도 나타나는지를 블랜드-알트만 플랏을 통해 확인했다. 마지막으로 제2형 당뇨병과 유관한 것으로 알려진 CpG들이 본 연구에 사용된 시계들에도 포함되어 있는지 확인하고, 또 해당 CpG들 중 본 연구에서 그룹 간 차이를 유의하게 나타낸 CpG들을 정리했다. 한국인 당뇨병 코호트에서 9가지 후생유전학 시계들을 적용시키고 위와 같은 다양한 방법으로 살펴본 결과 당뇨병 여부와 당뇨병 환자의 CKD 단계의 심화가 노화에 반영되는 시계는 Horvath, Hannum, AAHorvath, AAHannum, DunedinPACE였다. 또 제2형 당뇨병의 진행 상태가 심화되어 노화가 가속화된 환자가 많은 군일수록 다중선형회귀모델 중 공복 혈당 변수가 유의미하게 나타나고, 과소평가 경향성이 두드러지게 나타났다. 이상에서 제2형 당뇨병을 가진 한국인 코호트와 mAge/EAA는 연관성이 있었다. 따라서 본 연구는 한국인 당뇨병 환자의 노화 및 합병증 연구에 mAge/EAA를 사용할 수 있는 근거가 된다. 한편 한국인 당뇨병 코호트에서 하위군 간 유의한 차이를 갖는 T2D 관련 CpG들은 시계에 많이 포함되지 않은 것으로 나타났다. 따라서 T2D를 가진 한국인 코호트에서 노화 및 합병증을 연구하기 위해 이 CpG들을 포함하는 차세대 시계를 만들 것을 제안한다. 다만 두 코호트에는 당뇨병 중증도의 구성에 있어 차이가 있고 표본 크기가 작기 때문에 본 연구의 결과를 뒷받침할 후속 연구가 필요하다. 큰 샘플 사이즈가 확보된다면, 당뇨군과 컨트롤군의 나이를 동일하게 고정하여 mAge의 플랏에서의 기울기의 차이뿐만 아니라 절대적인 값의 차이를 보는 연구를 해볼 것을 제안한다.