Use of Probiotics to Improve Productivity of Pacific White Leg Shrimp (Penaeus vannamei) Aquaculture

Abstract

2026년까지 전세계 새우 시장 규모는 연평균 4.2% 성장해 234억 달러에 달할 것으로 예상되는 가운데, 양식 새우에서 발생하는 대표적인 수산생물 전염병인 흰 반점 바이러스, 급성간췌장괴사병(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)등은 새우 양식 산업에 막대한 경제적 손실을 끼치고 있다. 전염성 질병의 예방과 치료를 위해 항생제를 포함한 다양한 물질들이 사용되고 있다. 본 연구에서는 현재 새우 양식에서 가장 많이 양식되고 있는 흰다리새우의 양식 과정에서 생산성을 향상시키고 항생제 사용을 줄이기 위한 방안의 하나로 프로바이틱스의 기능적 활용에 대해 연구하였다. 대표적인 기능성 프로바이오틱스인 Bacillus spp. 균주를 사용하여 흰다리새우의 성장, 사료 효율, 비특이적 면역 반응에 미치는 연구와 항생제 대체제로서의 가능성에 대하여 연구하였다. Chapter 1에서는 Bacillus spp. 균주 3종(Bacillus subtilis, Bacillus velezensis, Bacillus pumilus)을 동일한 비율로 혼합한 사료 첨가물을 흰다리새우 사료에 혼합 첨가하여 성장, 사료 효율, 비특이적 면역 반응, 수질, 생존률에 대한 개선 효과를 평가하였다. Chapter 2에서는 B. velezensis를 활용한 AHPND의 병원체에 대한 항균 활성에 초점을 두어 연구를 진행하였다. Chapter 1에서는 Bacillus spp. 균주 복합물의 사료 첨가물로써 기능성을 평가하기 위해 흰다리새우의 기본 사료에 Bacillus spp. 균주 3종 복합물을 각각 다른 수준으로(0%, 0.05%, 0.1%, and 0.25%)첨가하여 4가지 실험 사료를 제작하였다. 흰다리새우(초기평균무게: 0.45g)는 총 20개의 수조에 각 70마리씩 5반복으로 배치하였고, 사양실험은 10주간 진행되었다. Bacillus spp. 균주 3종 복합물을 사료 내 0.1% 첨가한 실험구에서 대조구에 비해 유의적으로 높은 성장률, 단백질 효율, 사료전환율과 생존율이 관찰되었다. 0.05%와 0.1% Bacillus spp. 균주 3종 복합물을 첨가한 실험구는 대조구에 비해 소화 효소를 유의하게 증가시켰다. 또한, 0.1% Bacillus spp. 균주 3종 복합물을 첨가한 실험구는 혈액 및 면역 프로파일을 개선했을 뿐만 아니라 가장 높은 박테리아 제거 효율을 보였다. Bacillus spp. 균주 3종 복합물을 첨가한 모든 실험구는 V. parahaemolyticus를 투여한 공격 실험에서 대조구보다 누적 폐사율이 낮게 나타났다. 본 실험결과로 미루어 볼 때. 흰다리새우를 양식하는 과정에서 사료에 Bacillus spp. 균주 복합물을 첨가하여 공급하는 것은 흰다리새우의 성장성과 면역반응을 높이는데 효과적이라는 것을 보여주며, 0.1% 농도로 Bacillus spp. 균주 3종 복합물을 첨가하였을 때 가장 효과적인 것으로 판단된다. Chapter 2에서는 Bacillus spp. 균주의 항균 활성을 평가하고 이를 활용해서 흰다리새우 양식 과정에서 발생하는 AHPND의 제어 가능성에 대해 실험하였다. 제주 해수에서 분리한 5개의 Bacillus spp. 균주(B1, B3, B5, B7, B8)를 총 12개의 Vibrio 균주(AHPND 균주 10개 및 비 AHPND 균주 2개)에 대해 항균 활성을 평가하였다. 시험에 사용된 5개의 Bacillus spp. 균주는 dot-spot test에서 하나 이상의 Vibrio spp. 균주에 대해 성장을 억제하였다. 이 Vibrio spp. 균주 중, AHPND를 유발하는 V. campbellii(VcAHPND)에 대해 가장 효과적인 Bacillus spp. 균주인 B1과 B3 균주를 추가로 공격 실험에 사용하였다. 공격 실험에서VcAHPND를 흰다리새우에 노출시킨 결과, 48-60시간이 지난 초기 생존율의 경우 B1 Bacillus spp. 균주 처리구(100%)에서VcAHPND만 노출시킨 대조구(64.3%)보다 유의하게 더 높은 생존율이 관찰되었다. 공격 실험의 종료된 후, B1 Bacillus spp. 균주 처리구와 B3 Bacillus spp. 균주 처리구는 VcAHPND만 노출시킨 대조구보다 높은 누적 생존율을 보였다. 공격 실험에 사용된 흰다리새우의 간췌장조직에서 pirA 유전자를 qPCR 분석하여 확인한 Cycle Threshold(CT)값은 31.63 ± 0.2(B1 Bacillus spp. 균주 처리구) 및 38.04 ± 0.58(B3 Bacillus spp. 균주 처리구)인 반면 대조구(VcAHPND 처리구)에서는 28.70 ± 0.42였다. 유전자 분석 및 계통발생학적 분석 결과, 연구에 사용된 Bacillus spp. 균주 B1과 B3는 B. velezensis로 확인되었다. 이상의 결과에서, 흰다리생우 양식 기간 동안Bacillus spp. 균주 복합물(Bacillus subtilis, Bacillus velezensis, Bacillus pumilus)을 사료에 첨가하여 장기간 공급하는 것은 흰다리새우의 성장, 사료 효율, 사료 소화율, 면역 반응과 생존율을 효과적으로 개선시킬 수 있는 것으로 판단된다. 또한, B. velezensis의 자체 보유 유전자를 통한 항균 활성으로 AHPND와 같은 흰다리새우 양식 과정에서 발생할 수 있는 대규모 폐사 유발 질병에 대한 저항성을 높일 수 있는 것으로 판단된다. 이는 VcAHPND 와 같이 AHPND의 새로운 원인 병원체가 계속해서 확인되는 가운데 예방 및 치료를 위한 효과적인 사료첨가제로 사용될 수 있다. 따라서, 흰다리새우 양식 산업에서 Bacillus spp.를 활용하는 것은 흰다리새우 양식의 생산성을 향상시킬 수 있다고 판단된다.

The global shrimp market is expected to grow 4.2 percent annually to reach USD 23.4 billion by 2026. The aquatic infectious disease outbreaks that occur in shrimp aquaculture, including white spot syndrome virus (WSSV) and acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND), are causing huge economic losses to the shrimp culture industry. Various substances, including antibiotics, are used to prevent and treat infectious diseases. In this study, the functional use of probiotics was studied as one of the ways to improve productivity and reduce antibiotic use in shrimp aquaculture. We investigated the effect of a Bacillus spp. strain, a representative functional probiotic, on the growth, feed efficiency, and non-specific immune response in Pacific white leg shrimp (Penaeus vannamei), and the possibility of utilizing it as an antibiotic substitute. In Chapter 1, the shrimp feed diet supplemented with Bacillus spp. (Bacillus subtilis, Bacillus velezensis, and Bacillus pumilus mixed in equal ratios) was evaluated to determine the improvement effect on growth, feed efficiency, non-specific immune response, water quality, and survival rate. In Chapter 2, a study was conducted focusing on evaluating antibacterial activity to control aquatic infectious disease using the Bacillus strain. In Chapter 1, to evaluate the functionality of the Bacillus spp. mixture as a feed supplement, four experimental feeds were prepared by adding a mixture of three Bacillus spp. strains (B. subtilis, B. velezensis, and B. pumilus) to the basal diet of Pacific white leg shrimp at different levels (0%, 0.05%, 0.1%, and 0.2%). The Pacific white leg shrimp (initial average body weight: 0.45g) were randomly assigned to 500 L composite tanks (filled with 400 L of brackish water) at a stocking rate of 70 shrimp tank−1 for 10 weeks. There were five replicates per dietary treatment. The results showed that the diet containing 0.1% Bacillus spp. mixture significantly increased the growth, protein efficiency ratio, feed conversion ratio, and survival rate compared to that of the control. Diets containing 0.05% and 0.1% Bacillus spp. mixture significantly increased the digestive enzymes compared to that of the control. Furthermore, the diet containing 0.1% Bacillus spp. mixture significantly improved hematological and immune profiles. The total Vibrio spp. count was lowest in the diet supplemented with 0.1% of Bacillus spp. mixture; accordingly, the bacterial clearance efficiency was higher in this diet. The Pacific white leg shrimp fed the Bacillus spp. mixture diets (at 0.05%, 0.1%, and 0.2%) had lower cumulative mortality than the control after being challenged with Vibrio parahaemolyticus. Our results suggest that dietary supplementation with 0.1% Bacillus spp. mixture is the most effective in improving the performance and immunity of Pacific white leg shrimp. In Chapter 2, we evaluated the antibacterial activity of Bacillus strains and the possibility of controlling AHPND occurring during shrimp aquaculture. This study evaluated the antibacterial activity of five Bacillus strains (B1, B3, B5, B7, and B8)—isolated from seawater in Jeju, South Korea—against 12 Vibrio strains (10 AHPND strains and 2 non-AHPND strains). All tested Bacillus strains inhibited the growth of at least one of the tested Vibrio strains in the dot-spot method. Among them, B1 and B3, the most effective Bacillus strains against the Vibrio strains, particularly against AHPND-causing V. campbellii (VcAHPND), were further used in a challenge test. After 48–60 h of VcAHPND immersion, a significantly higher survival rate was observed in the B1-treated group (100%) than in the non-Bacillus-treated group (64.3%). Based on the qPCR analysis of AHPND, the cycle threshold values were 31.63 ± 0.2 (B1-treated group) and 38.04 ± 0.58 (B3-treated group) versus 28.70 ± 0.42 in the control group. Based on genome sequencing and phylogenetic analysis, B1 and B3 were classified as B. velezensis. Therefore, the long-term supply of Bacillus spp. strains during the aquaculture period is expected to improve the growth performance and increase the resistance to diseases such as AHPND, thereby increasing the productivity of the Pacific white leg shrimp aquaculture industry.