Pro-oncogenic Role of NRF2 in the Progression of Hepatocellular Carcinoma

Abstract

Hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) is highly expressed/activated in most hypoxic tumors including hepatocellular carcinoma (HCC). Another key transcription factor, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) is also constitutively overactivated in HCC. In an attempt to determine whether HIF-1α and NRF2 could play complementary roles in HCC growth and progression, I investigated the crosstalk between these two transcription factors and underlying molecular mechanisms in cultured HCC cells and experimentally induced hepatocarcinogenesis as well as clinical settings. While silencing of HIF-1α in HepG2 human hepatoma cells did not alter the protein expression of NRF2, NRF2 knockdown markedly reduced the nuclear accumulation of HIF-1α without influencing its mRNA expression. In diethylnitrosamine (DEN)-induced hepatocarcinogenesis in wild type mice, there was elevated NRF2 expression with concomitant upregulation of HIF-1α. However, this was abolished in Nrf2 knockout mice. NRF2 and HIF-1α co-localize and physically interact with each other which was verified by in situ proximity ligation and immunoprecipitation assays. In addition, the interaction between NRF2 and HIF-1α as well as their overexpression was found in specimens obtained from HCC patients. In normoxia, HIF-1α undergoes hydroxylation by a specific HIF-prolyl hydroxylase domain protein (PHD), which facilitates ubiquitination and proteasomal degradation of HIF-1α. NRF2 contributes to pseudohypoxia by directly binding to the oxygen-dependent degradation domain of HIF-1α. This hampers the PHD2-mediated hydroxylation, which facilitates the recruitment of von-Hippel-Lindau and ubiquitination of HIF-1α. NRF2 is a key transcription factor involved in protection against initiation of carcinogenesis in normal cells. However, recent studies have demonstrated that aberrant activation of NRF2 accelerates the proliferation and progression of cancer cells. The differential effects of NRF2 on multi-stage carcinogenesis have raised a concern about the validity of NRF2 activators for chemoprevention. This prompted me to assess the effects of sulforaphane (SFN), a prototypic NRF2 activating chemopreventive phytochemical, on experimentally induced hepatocarcinogenesis. For this purpose, SFN was daily injected intraperitoneally (25 mg/kg) for 3 months to male C57BL/6 mice at 6 months after single intraperitoneal administration of a hepatocarcinogen, DEN. The liver to body weight ratio, tumor growth, and the number and the size of hepatomas measured at 9 months after DEN administration were significantly higher in SFN-treated mice than those in vehicle-treated mice. Moreover, the expression of NRF2, its target protein NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, and the cell proliferation marker, proliferating cell nuclear antigen was further elevated in DEN plus SFN-treated mice. These results suggest that once hepatocarcinogenesis is initiated, SFN may stimulate tumor progression.

저산소증 유발인자-1α(HIF-1α)는 간세포암을 포함한 대부분의 저산소성 종양에서 고도로 발현된다. 산화환원에 민감한 전사인자인 NRF2도 간세포암에서 지속적으로 과발현된다. 이 두 전사인자가 간세포암의 증식과 진행에 서로 보완적인 역할을 할 수 있을 지 알아보기 위하여 배양된 간세포암세포주, 실험적으로 유도된 간암 마우스모델과 간세포암환자의 조직검체에서 생물학적 메커니즘을 고찰하였다. HepG2 인체 간세포암 세포주에서 HIF-1α는 NRF2의 단백질 발현에 관여하지 않는 걸로 확인 된 반면, NRF2는 HIF-1α의 단백질 발현과 세포핵에서의 축적에 유의미한 영향을 주는 것으로 확인되었다. 그러나 NRF2는 HIF-1α의 mRNA 레벨에는 영향을 미치지 않는 것으로 유추해보면 NRF2는 HIF-1α의 안정화에 긍정적으로 관여할 것으로 예상되었다. 따라서 면역침전 및 PLA로 분석해본 결과 NRF2는 HIF-1α와 세포질에서 직접적인 결합으로 상호작용 하는 것으로 확인되었다. 디에틸니트로사민(DEN)으로 유도된 간암 마우스에서도 NRF2와 HIF-1α의 과발현이 확인되었고 HIF-1α의 과발현은 NRF2 녹아웃 유전자변형 마우스에선 관측되지 않았다. 또한 이러한 NRF2와 HIF-1α의 과발현 및 상호작용이 간세포암 환자로부터 얻은 검체에서도 확인되었다. 추가적으로, NRF2는 HIF-1α의 산소의존적분해(ODD) 도메인에 직접 결합하는 것으로 확인되어 PHD2에 의한 HIF-1α의 하이드록실화를 방해하는 메커니즘을 규명하였다. 정상산소 상태에서 HIF-1α는 VHL에 의한 유비퀴틴화 및 proteasome에 의한 분해과정을 겪는데 NRF2와의 상호작용으로 HIF-1α가 안정화 되는 것으로 보인다. NRF2는 정상세포를 발암으로부터 보호해주는 핵심 전사인자이다. 그러나 NRF2는 암세포도 보호해주는 것이 보도되었다. 특히, 최근 연구에 따르면 NRF2의 활성화가 암세포의 증식과 진행을 가속화한다는 것이 입증되었다. 이러한 NRF2의 이중 효능은 화학적암예방을 위한 NRF2 활성제의 타당성에 대한 우려를 자아낸다. 따라서 NRF2 활성제중 하나인 설포라판(SFN)의 투여가 실험적으로 유도된 간세포암 마우스모델에서 어떠한 효과를 나타낼 지 흥미롭게 생각하였다. 본 연구에서는 간암유도 물질인 DEN을 1회 복강투여한 후 6개월차부터 3개월 동안 매일 SFN을 복강으로 투여하였다. 9개월차에 부검 시 측정된 간/체중 비율, 종양크기를 확인해보면 SFN 처리한 마우스에서 오히려 유의하게 더 증가되었다. DEN으로 처리한 마우스중, NRF2, NRF2의 표적 단백질 NQO1 및 세포증식 마커인 PCNA의 발현이 SFN 처리군에서 더 높은 양상을 보여주었다. 결과적으로, 간세포암 발생이 시작되면 NRF2는 간세포암의 증식과 종양의 진행을 더 자극하여 촉진할 수 있음을 시사한다.