유해자극 감지성 척수후근신경절 세포와 피부 기능 관련 이온통로들에 대한 천연물 성분 α-Mangostin과 Echinochrome A의 효과

Abstract

Garcinia mangostana Linn. (mangosteen)의 과피에서 분리된 크산톤 (Xanthone) 화합물인 α-mangostin은 동남아시아 지역에서 민간요법으로 사용되며, 성게의 가시에서 추출한 암적색 색소인 Echinochrome A (Ech A)는 러시아에서 항염증 효과 등을 통한 치료제로 제시되었다. 본 연구는 이 두 물질들의 다양한 이온채널에 대한 효과를 전세포 팻취클램프 기법으로 분석하였다. 특히 통각을 담당하는 척수 후근 신경절 (Dorsal root ganglion, DRG) 뉴런 및 피부 각질형성세포, 그리고 면역세포에서 중요한 역할을 하는 이온채널들을 대상으로 하였다. 세포 직경이 작은 DRG 뉴런들에서 α-mangostin 처리 (0.3-3 μM)는 안정막 전위 과분극과 막전도도 증가 및 활동전압 발생 억제를 일으켰다. 막전위 과분극 현상을 규명하기 위해 HEK293T에 과발현시킨 two-pore K+ 채널들 (TREK-1/-2, TRAAK, TRESK)에 α-mangostin을 투여해 보면, TREK과 TRAAK은 뚜렷이 활성화되었으나 TRESK는 변화가 없었다. α-mangostin (3 μM)은 DRG 뉴런과 ND7/23 신경세포주 세포에 있는 Na_v의 기능을 40% 가량 억제하였다. 또한 잘 알려진 통각 수용체인 TRPV1 채널을 캡사이신으로 활성화시킨 상태에서는 α-mangostin (0.3 μM)에 의해 뚜렷한 억제를 보였다. 흥미롭게도 산성 pH 조건으로 활성화시킨 TRPV1에 대해서는 α-mangostin에 의한 억제효과가 없었다. 분자간 결합 시뮬레이션을 통해 해당 이온채널들과 α-mangostin의 안정적 결합을 유추할 수 있었다. In Silico ADME 실험은 α-mangostin의 생체적합성을 시사하였다. Ech A의 작용은 HEK293 세포에 과발현시킨 이온채널들을 대상으로 확인하였다. 각질형성세포 기능에 중요한 TRPV3와 면역세포 칼슘신호에 필수적인 Orai1을 통한 전류는 수 μM의 Ech A에 의해 억제되었다. 반면 캡사이신으로 활성화된 통각수용체인 TRPV1은 Ech A를 추가 처리할 경우 더 활성화되었다. TREK-2는 Ech A의 단독 처리로는 아무 변화가 없지만, 2-APB나 아라키돈산 및 세포 외 pH 산성화 조건으로 부분 활성화시킨 상태에서 Ech A를 추가 투여 시 전류 크기가 강력하게 증강되었다. TREK-1과 TRAAK에서도 유사한 활성 증강을 보였으나 TASK-1과 TRESK는 그렇지 않았다. 흥미롭게도 2-APB와 Ech A를 함께 처리하여 증강 활성화된 TREK-2는 잘 알려진 억제제인 Norfluoxetine으로도 억제되지 않았다. 그렇지만 TREK-2에 대한 결합부위가 Norfluoxetine과 다른 것으로 알려진 Ruthenium red의 억제는 여전하였기 때문에, Ech A에 의한 TREK-2 구조 변형에 대한 흥미로운 추측을 제시하였다. 본 연구를 통하여, 이전의 in vivo 실험으로 알려진 α-mangostin의 진통 작용이 DRG뉴런의 여러 이온채널들을 통하여 일어날 가능성을 제시하였다. 또한 최근 주목받고 있는 해양동물 유래 성분인 Ech A의 다양한 치료작용을 이해할 수 있는 근거로, TRPV3와 Orai1의 억제 및 TREK/TRAAK 이온채널의 활성 증강 효과를 제시할 수 있었다.

In this study, I investigated the effects of α-mangostin, a xanthone isolated from the pericarp of Garcinia manogstana Linn (mangosteen), and Echinochrome A (Ech A), a dark red pigment isolated form the spines of sea urchins, on the ion channels playing key roles in the nociception and protective functions of skin. Although previous studies indicated anti-inflammatory and analgesic effects of the two compounds, their pharmacological actions on the relevant ion channels have not been conducted yet. Whole-cell patch clamp study using mouse small dorsal root ganglion (DRG) neurons and HEK293T cells overexpressed with TRPV1 and various two-pore domain K+channels (TREK-1, TREK-2, TRAAK, TRESK) revealed that micromolar ranges of α-mangostin (1–3 μM) inhibits TTX-sensitive voltage-gated Na+ channel (NaV) and TRPV1 channel, while activating TREK-1, TREK-2 and TRAAK. The multiple effects on the DRG neuronal ion channels resulted in the membrane hyperpolarization and inhibition of action potential firing as well as the nociceptive receptor potential. Molecular docking simulation suggested that a-mangostin stably binds with the ion channels. Furthermore, in silico ADME tests revealed that a-mangostin satisfies drug-likeness properties. Then I investigated the effects of Ech A on the TRPV3, CRAC, TRPV1, TREK-1, TREK-2, TRAAK, TRESK and TASK-1 channels overexpressed in HEK 293 cells. Ech A inhibited TRPV3 and CRAC current with IC50 of 2.1 and 2.4 µM, respectively. The capsaicin-activated TRPV1 current was slightly augmented by Ech A. Although Ech A alone did not change the amplitude of TREK-2 current (ITREK2), a partial activation of TREK-2 by known agonists (2-APB, arachidonic acid, acidic extracellular pH) could be markedly augmented by the combined application of Ech A. Similar facilitation effects of Ech A on TREK-1 and TRAAK were observed when stimulated with 2-APB and arachidonic acid, respectively. On the contrary, Ech A did not affect TRESK and TASK-1 currents. Interestingly, the ITREK2 maximally activated by the combined application of 2-APB and Ech A was not inhibited by norfluoxetine, but was still completely inhibited by ruthenium red. The selective loss of sensitivity to norfluoxetine suggested altered molecular conformation of TREK-2 by Ech A. The molecular docking simulation also indicated a common site with similar binding energy with norfluoxetine and Ech A. Above studies suggest that a-mangostin might be a candidate analgesic agent with multi-target modulation of ion channels. Also, I suggest that the Ech A-induced inhibition of Ca2+ permeable cation channels and facilitation of TREK/TRAAK K2P channels might underlie the analgesic and anti-inflammatory effects of Ech A.