Polo-like kinase 1 regulates chromosomal instability and paclitaxel resistance in breast cancer cells

Abstract

염색체 불안정성은 세포 간 유전적 이질성에 기여하며 유방암에서 파클리탁셀 저항성과 관련되어 있으므로, 본 연구에서는 유사분열 과정의 중요한 조절인자인 PLK1 유전자가 유방암에서 파클리탁셀 내성에 미치는 영향과 예측 바이오마커로서 유용성에 대해 탐색하였다.

1장에서는 암세포의 항암제 저항성 현상에 대한 일반적인 개요를 설명한다. 파클리탁셀은 삼중 음성 유방암에서 일반적으로 사용되는 세포독성 항암제이며, 미세소관 형성과 다핵화를 통해 암세포 사멸을 유도한다. 최근 유방암 염색체 불안정화가 심해질수록 파클리탁셀에 좋은 반응을 유도한다는 새로운 연구결과가 보고된 바 있다. 그러나, 염색체 불안정화는 종양의 진행과 전이를 촉진시킨다는 실험결과가 여러 연구에서 기존에 제시된 바 있다. 이처럼 염색체 불안정화가 암세포에 미치는 모순된 결과는 염색체 불안정성은 그 최적 상태에서는 종양 진행을 촉진할 수 있으나, 그 범위 외에서는 암세포 생존을 방해할 수 있다는 가능성을 제시한다. 이런 연구결과를 토대로 본 연구에서는 염색체 불안정화에 삼중음성 유방암에서 항암제 내성에 어떻게 관여하는지를 탐구하고자 한다.

2장에서는 유방암 세포에서 파클리탁셀 저항성과 관련된 유전자를 kinome-wide CRISPR/Cas9 스크리닝을 통해 발굴하는 과정과 그 후보유전자 중 선택된 PLK1이 삼중음성유방암에서 가지는 역할을 실험적으로 증명한 결과를 제시하였다. 유방암 세포에 대한 PLK1의 효과를 확인하기 위해 유방암 세포주를 이용하여 세포 증식 및 세포 사멸 분석을 진행하였고, PLK1 억제는 in vitro에서 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468 세포의 증식을 억제하였고, 유방암 세포의 파클리탁셀에 대한 반응성을 향상시킴을 확인하였다. 또한, 공개된 유방암 유전체 데이터를 분석하여 PLK1의 발현정도와 환자의 생존율과의 연관성을 확인하였다. 이 결과를 토대로 PLK1 표적화는 파클리탁셀 내성 유방암에 대한 효과적인 치료 전략이 될 수 있고, 유방암 환자에서 파클리탁셀 기반 항암치료에서 반응성을 예측하는 바이오마커로 사용될 수 있다는 가능성을 확인하였다.

3장에서는 유방암 세포에서 PLK1이 파클리탁셀 저항성에 관여하는 생물학적 기전을 염색체 불안정성을 조절하는 기능을 통해 설명하였다. RNA sequencing 실험을 통해 PLK1을 억제한 유방암세포에서 염색체 이상분열 유전자의 활성도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이후 세포분열 과정을 관찰하는 실험을 통해 PLK1 억제가 다극 방추체의 형성을 유도하고 다극성 세포의 비율을 증가시키는 과정을 통해 정상적인 세포분열과정을 저해하는 현상을 관찰하였고, 세포분열의 조절에 필수적인BubR1 및 Mad2의 발현 저하 및 BubR1의 kinetochore localization의 감소를 확인하였다. 동물실험에서도 PLK1 저하는 생체내 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468 세포의 증식을 억제하였고, MDA-MB-231 이종이식 마우스 모델에서 파클리탁셀 약물 반응성을 증가시키는 것을 확인하였다. 동시에 종양조직에서도 PLK1 억제는 다극성 세포의 비율을 유의하게 증가시키는 효과를 보였다. 이런 결과를 토대로 PLK1 저하가 염색체 불안정 및 다극방추체 형성을 조절하여 파클리탁셀 반응성에 관여한다는 기전을 제시할 수 있었다.

이 논문의 일부 내용은 논문에 인용된 바와 같이 학술지(Journal of Breast Cancer)에 발표 되었다[79].

Chromosomal instability (CIN) contributes to intercellular genetic heterogeneity and has been implicated in paclitaxel (PTX) resistance in breast cancer. In this study, I explored polo-like kinase 1 (PLK1) as an important regulator of mitotic integrity and as a predictive biomarker for PTX resistance in breast cancer.

In Chapter 1, provides a general overview of anti-cancer drug resistance and cell heterogeneity. PTX is a commonly used cytotoxic chemotherapeutic agent for triple-negative breast cancer (TNBC). PTX causes cancer cell death by stabilizing microtubules and inducing multinucleation and cell cycle arrest. Emerging evidence suggests that CIN in breast cancer might serve as a predictor of PTX response. Furthermore, extensive published data have shown that CIN is associated with various malignant features in multiple types of human cancers. Of note, recent studies have shown that CIN is also associated with PTX sensitivity in breast cancer, although varying results suggest that there may be an optimal threshold of CIN for tumor progression, beyond which further CIN may be deleterious for cancer cell survival. However, detailed studies exploring potential nonlinear relationships between CIN and therapeutic resistance in breast cancer are lacking.

In Chapter 2, genes related to PTX resistance are identified through a kinome-wide CRISPR/Cas9 screen in breast cancer cells. Among the top candidate genes identified, PLK1 was chosen for further experiments. In vitro cell proliferation and apoptosis assays were performed to determine the effects of PLK1 inhibition on breast cancer cells. PLK1 knockdown inhibited the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells in vitro. Moreover, PLK1 silencing sensitized breast cancer cells to PTX. PLK1 upregulation in primary breast cancer tumors was associated with decreased overall patient survival based on the analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium (METABRIC) databases. Lower PLK1 expression levels were associated with increased response to neoadjuvant chemotherapy (NAC) in breast cancer. Data from these studies suggest targeting PLK1 may be an effective treatment strategy for PTX-resistant breast cancer. Overall, PLK1 levels served as an independent predictor of PTX-based NAC response in breast cancer.

In Chapter 3, the mechanistic role through which PLK1 regulates CIN and PTX resistance was further explored in breast cancer cells. RNA-sequencing (RNA-Seq) analysis revealed that PLK1 depletion leads to changes in gene expression signatures associated with chromosome missegregation. Immunofluorescence microscopy was used to measure the degree of multipolar cell division. Silencing of PLK1 induced the formation of multipolar spindles and increased the percentage of multipolar cells. In addition, PLK1 silencing resulted in the downregulation of BubR1 and Mad2, which are key regulatory proteins for spindle assembly checkpoint (SAC) activity in prometaphase. Furthermore, kinetochore localization of BubR1 was significantly reduced in PLK1-silenced breast cancer cells. In addition, PLK1 knockdown inhibited the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells in vivo and sensitized mouse xenograft tumor models to PTX cytotoxicity. In agreement with in vitro experiments, PLK1-silenced xenograft tumors showed significantly increased multipolar spindles similar that of PTX-treated xenograft tumors. In conclusion, PLK1 promotes multipolar spindle formation, which can lead to increased PTX sensitivity.