Molecular mechanism of the vernalization-induced expression of COOLAIR, an Arabidopsis long noncoding RNA

Abstract

To synchronize flowering time with spring, many plants undergo vernalization, a floral-promotion process triggered by exposure to long-term winter cold. In Arabidopsis thaliana, this is achieved through cold-mediated epigenetic silencing of the floral repressor, FLOWERING LOCUS C (FLC). COOLAIR, a cold-induced antisense RNA transcribed from the FLC locus, has been proposed to facilitate FLC silencing. However, how cold induces COOLAIR expression has yet to be understood. Here, I show that C-repeat (CRT)/dehydration-responsive elements (DREs) at the 3′-end of FLC and CRT/DRE-BINDING FACTORs (CBFs) are required for cold-mediated expression of COOLAIR. CBFs bound to CRT/DREs at the 3′-end of FLC, both in vitro and in vivo, and CBF levels increased gradually during vernalization. Cold-induced COOLAIR expression was severely impaired in cbfs mutants in which all CBF genes were knocked-out. Conversely, CBF-overexpressing plants showed increased COOLAIR levels even at warm temperatures. I show that COOLAIR is induced by CBFs during early stages of vernalization but COOLAIR levels decrease in later phases as FLC chromatin transitions to an inactive state to which CBFs can no longer bind. I also demonstrate that cbfs and FLCΔCOOLAIR mutants exhibit a normal vernalization response despite their inability to activate COOLAIR expression during cold, revealing that COOLAIR is not required for this process.

온대 기후 지역에 서식하는 식물로서는 기후가 온화할 뿐 아니라 수분매개자들이 활발히 활동하는 봄에 한꺼번에 개화하는 것이 생식에 유리하다. 이 때문에 이 지역 식물종 중 다수는 겨우내 장기간 지속되는 저온에 감응하여 개화가 유도되는 춘화 현상을 겪는다. 모델식물인 애기장대에서는 개화 억제 유전자인 FLOWERING LOCUS C (FLC) 가 후성유전학적으로 저해됨에 따라 춘화 현상이 일어난다. 장기간 지속되는 저온 환경에 의해 발현이 증가하는 인자들이 이 과정을 매개하는 것으로 알려져 있는데, FLC 좌위에서 발현하는 역배열 RNA 인 COOLAIR 가 대표적 예다. COOLAIR 의 생화학적 기능은 비교적 상세히 규명되었지만 이들 발현이 어떻게 장기 저온 환경에 의해 유도되는지는 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 COOLAIR 발현이 장기 저온 환경에 의해 유도될 수 있게끔 하는 데 필수적인 cis-regulatory element 를 발굴하고, 이를 통해 COOLAIR 발현이 활성화되는 기전을 밝히는 데 주안점을 두었다. COOLAIR 프로모터 부위에 해당하는 FLC 3′ 말단 구역에 진화적으로 보존된 C-repeat (CRT)/dehydration-responsive element (DRE) 가 존재함을 확인하였다. 저온 내성 매개 단백질인 CRT/DRE-BINDING FACTOR 3 (CBF3) 는 식물 체외, 체내 모두에서 FLC 3′ 말단 구역의 CRT/DRE 에 결합했다. 세 종류의 CBF 단백질들이 모두 무력화된 cbfs 돌연변이체에서는 장기 저온 환경에도 불구, COOLAIR 발현이 정상적으로 유도되지 않는 반면, CBF3 과발현체는 상온에서도 높은 COOLAIR 발현량을 보였다. 이로 미루어 볼 때 CBF 단백질이 춘화 현상 동안 COOLAIR의 발현을 활성화시키는 인자임을 알 수 있었다. 장기 저온 환경에 노출되었을 때 CBF 메신저 RNA 와 단백질 양이 모두 점진적으로 증가한다는 사실을 감안하면 CBF 양 증가가 COOLAIR 발현 유도로 이어짐을 추론할 수 있다. 반면, 저온 환경이 더 오래 지속되면 CBF3 단백질이 COOLAIR 프로모터 부위로부터 분리되는데, 이 때문에 춘화 현상 말엽 COOLAIR 발현이 다시 감소하는 것으로 사료된다. cbfs 돌연변이체와, CRT/DRE 를 포함하는 COOLAIR 프로모터 구역이 결실된 FLCΔCOOLAIR 돌연변이체에서는 COOLAIR 발현이 장기 저온 환경에 의해 활성화되지 못함에도 불구하고 FLC 의 후성유전학적 저해와 개화 유도가 야생형 식물과 다를 바 없이 일어났다. 이는 COOLAIR 가 춘화현상에 필수적인 인자는 아님을 시사한다. 결국, 본 연구는 지금까지 충분히 규명되지 않은, 춘화현상 동안의 장기 저온 신호 전달 경로를 새롭게 밝혔다는 점에서 그 의의가 크다. 이뿐 아니라 지금껏 논쟁의 대상이었던, 후성유전학적 FLC 저해 과정에서의 COOLAIR 의 기능과 관련해 신뢰성이 높으면서도 단순명료한 반박 증거를 새로이 제시했다.