Regulation of autophagic activity by Vps34 phosphorylation in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Macroautophagy/autophagy is a key catabolic pathway in which double-membrane autophagosomes sequester various substrates destined for degradation, allowing cells to maintain homeostasis and survive under stressful conditions. Several autophagy-related (Atg) proteins are recruited to the phagophore assembly site (PAS) and orchestrate to manage autophagosome biogenesis. Vps34 is a class III phosphatidylinositol 3-kinase, and Atg14-containing Vps34 complex I plays essential roles in the initial steps of autophagy induction. However, the regulatory mechanisms of yeast Vps34 complex I are still poorly understood. Here, I report that Atg1-dependent phosphorylation of Vps34 is required for robust autophagy activity in Saccharomyces cerevisiae. Following nitrogen starvation, Vps34 in complex I is selectively phosphorylated on multiple serine/threonine residues in its helical domain. This phosphorylation promotes full autophagy activation and cell survival. In vivo phosphorylation of Vps34 was completely disrupted in the absence of Atg1 or its kinase activity, and Atg1 directly phosphorylated Vps34 in vitro, regardless of its complex association type. I also revealed that localization of Vps34 complex I to the PAS provides molecular basis for complex I-specific phosphorylation. This phosphorylation is required for the normal dynamics of Atg18 and Atg8 at the PAS. Together, this study reveals a novel regulatory mechanism of yeast Vps34 complex I and provides new insights into the Atg1-dependent dynamic regulation of the PAS.

자가포식은 진핵 생물 전반에 걸쳐 잘 보존된 세포 내 물질 분해 기전이다. 다양한 외부 스트레스에 대해 세포는 자가포식 작용을 통해 세포 내 여러 고분자 물질 및 비정상적인 세포 소기관 등을 분해함으로써 세포 내 재구성을 위한 영양분을 재생산함과 동시에 세포 독성 물질을 효과적으로 제거할 수 있다. 자가포식 유도 시 Phagophore assembly site (PAS) 에 자가포식 연관 (Atg) 단백질들이 결집하게 되고 이들 단백질 군의 상호 협력적인 작용을 통해 자가포식 소체 (autophagosome) 가 생성된다. Vps34는 제 3 군 포스파티딜이노시톨 3-인산화 효소 (class III phosphatidylinositol 3-kinase) 로서 Vps34 1형 복합체 (Vps34 complex I) 는 PAS에서 autophagosome형성에 핵심적인 역할을 수행하지만 Vps34 1형 복합체의 분자적 조절 기전에 대해 알려진 바는 제한적이다. 본 연구에서는 출아 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 에서 Vps34 1형 복합체의 인산화를 통한 자가포식 조절 기전을 분석하였다. 자가포식 유도 조건인 질소 결핍 시 Atg1 의존적으로 Vps34인산화가 일어나고 이 인산화가 자가포식을 활성화 하고 질소 기아 조건에서 세포 생존을 유지하는 데 중요하다는 것을 확인했다. 이러한 Vps34 의 인산화는 1형 복합체 특이적으로 발생하며 Atg1 인산화 효소 유전자가 결실 될 시 완전히 저해되었다. 시험관 내 인산화 효소 반응 (in vitro kinase assay) 을 통해 Atg1 인산화 효소가 Vps34 복합체 유형에 관계 없이 직접적으로 Vps34 를 인산화 시킬 수 있음을 확인했으며 Vps34 1형 복합체-특이적인 인산화가 1형 복합체만이 PAS 로 이동할 수 있기 때문임을 밝혔다. 나아가 Vps34의 인산화가 PAS에서의 Atg18 및 Atg8를 포함한 하위 Atg 단백질들의 역학 조절에 중요하다는 것을 확인했다. Vps34의 인산화 조절에 관한 본 연구는 현재까지 미비했던 Vps34 1형 복합체의 인산화 조절에 대한 새로운 분자적 조절 기전을 밝혀내었고 또한 Atg1-의존적인 PAS 역학 조절에 대한 추가적인 지식을 제공함으로써 향후 자가포식 연구에 중요한 과학적 기반으로 활용될 수 있을 것이다.