3D Printed Mesh-Microfluidic Platform for Generating Large Scale Vascularized Spheroids

Abstract

장기칩(Organ-on-a-chio)은 고도로 생체 환경을 모사하여 복잡한 생체 환경을 작은 미세유체(microfluidic) 플랫폼에 구현하는 체외 모델이다. 미세유체 기술의 발전으로 모세관류(Capillary flow)를 활용한 다양한 역학적 해석(Concus-Finn condition, Spontaneous Capillary Flow condition 등)을 통하여 미세 채널에 소량의 유체를 정밀하게 조작하고 제어하여 복잡한 세포 미세환경 구현이 가능하여 장기칩은 더욱 정교해지고 기존에서 구현하지 못했던 복잡한 체내 구조나 다양한 배양 환경 구현이 가능하다. 특히 실제 종양 미세환경(Tumor microenvironment)를 구현하기 위하여 혈관화된 종양 (Vascularized spheroid) 혹은 오가노이드(Vascularized organoid) 모델에 대한 연구의 중요성은 점점 커지고 있다. 혈관화된 모델은 복잡한 체내와 유사한 환경을 제공하여 다양한 약물에 대한 독성 시험, 유동 순환 시스템 연구에 활용되어 한 단계 더 진보된 결과를 기대할 수 있다. 혈관화된 모델에서는 배양 조직, 종양 또는 혈관의 형태(morphology), 기관 생리학(organ physiology), 약물 반응 등에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있으며 이러한 데이터들을 추적하여 다양한 결과를 도출할 수 있다. 그러나 이러한 플랫폼은 두 가지 한계점을 지니고 있다. 첫째, 지금까지의 종양 미세환경 플랫폼은 소규모 종양(~400μm)의 공배양하여 다양한 약물 스크리닝과 연구가 진행되었다. 허나 실제 체내의 환경은 이보다 훨씬 대규모 스케일의 실제 조직이나 오가노이드(1000μm ~ 2000μm)가 자라며 이를 실제로 구현할 수 있는 새로운 플랫폼 연구의 필요성이 대두된다. 둘째, 장기칩 분야는 지속적으로 발전하여 실험 수율과 효율이 증가하기에 많은 양의 실험 데이터를 생산할 수 있는 조건이 갖춰졌다. 하지만 장기칩은 3D 종양 미세환경을 구현하였기에 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 활용하여 이미징 데이터를 생산한다. 공초점 현미경은 높은 퀄리티의 이미징을 제공해주지만 비용이 비싸며 이미징 시간이 길다는 단점으로 모든 데이터를 처리할 때 병목 현상이 발생한다. 한계점을 극복하기 위해 두 가지 해결책을 제안한다. 첫째, 기존의 장기칩에서 활용하는 레일 구조(Rail guided structure)와 메쉬 구조(Mesh-assisted structure)를 결합하여 대규모 스케일의 혈관화된 조직이나 오가노이드를 배양할 수 있는 새로운 플랫폼인 Vascularized Tissue-Micromesh Assisted Platform (VT-MAP)을 소개합니다. VT-MAP은 소규모 종양 모델을 벗어나 단순히 대규모 종양을 손쉽게 배양할 수 있을뿐만 아니라 혈관화된 종양 모델을 제공하여 혈관을 통한 약물 전달 모델을 제공할 수 있다. 이를 통해 VT-MAP은 기존의 체외모델의 한계를 극복하고 새로운 약물 개발과 정밀의학 연구에 새로운 가능성을 줄 것으로 기대한다. 둘째, 기존의 공초점 현미경 이미징 시스템을 벗어나 신속한 처리가 가능한 비표지방식의 가상염색(Label-free virtual staining method) 기법인 Virtual Staining-assisted Injection Molded Plastic Array 3D Culture System (VS-IMPACT)을 소개한다. VS-IMACT는 SegNet과 cGAN을 활용한 딥러닝 기반 알고리즘이며 혈관의 brightfield 이미지에서 바로 공초점 이미지(confocal image) 급의 형광 이미지를 별도의 처리 과정 없이 즉시 얻을 수 있다. 기존의 공초점 현미경 이미징 과정에서 반드시 필요한 면역세포화학 염색법(immunocytochemistry staining method)을 생략할 수 있으며 비표지방식의 실시간 세포 이미징 (label-free live cell imaging)이 가능하여 비파괴 및 실시간 혈관 모니터링이 가능하여 성장하는 양상을 손쉽게 확인하고 가상으로 염색된 데이터를 얻을 수 있다. 이 방식을 활용하면 종양 미세환경에서 혈관 생성 억제제나 항암제에 대한 반응을 평가할 수 있다. 본 논문에서 개발한 VT-MAP과 VS-IMPACT를 활용하면 종양 미세환경 연구의 한계점을 극복하고 새로운 연구 방식을 제시할 수 있을 것으로 기대한다.

Organ-on-a-chip is a microfluidic platform for studying complex biological systems by developing biomimetic in vitro models. With the advancements of microfluidic technology, which refers to the manipulation and control of small amounts of fluid at microchannels, precise and dynamic control over cellular microenvironments is enabled. This allows organ-on-a-chip models to become more sophisticated, enabling the implementation of complex in vivo structures and diverse cell culture environments. Vascularized spheroids or organoids are becoming increasingly important in research to recreate the actual tumor microenvironment. Vascularized models offer a more sophisticated in vivo-like environment, allowing for the utilization of diverse drug toxicity tests through microvessels and studies on flow circulation systems with microfluidics, leading to more advanced results. In vascularized models, important data regarding cultured tissues, tumor or microvessels morphology, and cell-to-cell mechanisms by organ physiology and drug responses can be obtained, allowing for valuable outcomes by tracking and analyzing such data. Thus, organ-on-a-chip have been pivotal in engineering complex in vitro models, such as cancer, infectious diseases, multi-organ system and lymphatic and interstitial flow in the tumor microenvironment, allowing researchers to study disease progression and mechanisms. However, these platforms have encountered two main limitations. Firstly, the microfluidics-based tumor microenvironment platforms were sufficient for co-culturing small-size tumors, but with the emergence of 3D tissues or organoids, designs that can accommodate larger tissues/explants/spheroids are required. Secondly, as the platforms have advanced, the throughput of experiments has increased dramatically, but imaging systems have not kept pace. Typically, organ chips implement 3D tumor microenvironments and use confocal microscopes for detailed imaging. However, due to the cost and poor accessibility of confocal microscopes, there is a bottleneck in screening large amounts of imaging data from high-throughput imaging microscopes. In this thesis, I introduce two new technologies: Large scale Vascularized Tissue Mesh-Assisted Platform (VT-MAP). VT-MAP is an innovative platform that combines the existing rail-assisted structure with the mesh-assisted structure, enabling the development of large-scale vascularized tissue or organoid models. The platform can provide not only co-cultivation of large-sized single organoids but also enable the cultivation of clusters distributed in various sizes. Additionally, VT-MAP is a platform applicable for drug screening and precision medicine research, providing valuable insights into the drug response evaluation of cells and enabling more accurate and reliable data acquisition. This allows VT-MAP to offer a deeper understanding of the cultivation of vascularized tissues or organoids and drug responses. VT-MAP is expected to overcome the limitations of current in-vitro models and open new possibilities for drug development and precision medicine research by vascularized tissues and organoids. High-efficiency label-free virtual staining network based on deep learning. Virtual staining provides an effective solution to obtain fluorescent-like images from simple brightfield microscope images without the immuno staining process and relying on traditional microscope equipment. Currently, researchers are exploring methods to achieve virtual staining without the need for conventional cell staining or tissue staining techniques in various fields of biology. Moreover, I have extended the application of virtual staining to label-free live cell imaging. Virtual live cell imaging represents an innovative approach that allows for the real-time visualization of cellular dynamics without relying on traditional staining techniques. Through the utilization of advanced virtual staining networks and quantitative analysis algorithms, real-time virtual live cell imaging enables the conversion of brightfield images into label-free virtual fluorescence images. This technique provides valuable insights into the behavior and interactions of live cells within their native microenvironment. I believe that these two technologies have the potential to enhance the field of organ-on-a-chip research in terms of throughput and data analysis. By overcoming the limitations of current platforms, VT-MAP and virtual staining will enable the development of more sophisticated and realistic models of human tissues and organs. This will lead to a better understanding of disease mechanisms and the development of more effective treatments.