Development and Clinical Application of the Encoded Bead-Based Multiplex Assay Platform

Abstract

The same symptoms may come from various diseases. Therefore, many diagnoses are performed using biomarkers in blood, sputum, urine, and cerebrospinal fluid (CSF). Compared to single analysis methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), multiplex diagnosis can improve workflow and save patient samples, reagents, consumables, and test time. In particular, the advantage of reducing the amount of patient samples is that it can increase test accessibility by reducing the burden of sample collection in addition to financial benefits. Furthermore, the high accuracy obtained by combining multiple biomarkers can increase the possibility of early diagnosis through routine tests. In a multiplex assay platform using coded beads, different probes are attached according to the code assigned to the beads and hundreds or thousands of beads are mixed and reacted with patient samples. By checking the code of beads, i.e. the type of probe, various biomarker information can be obtained. Although the concept of the technology had been proven before my joining, it was insufficient for use in actual diagnostic markets due to a lack of production volume, variation in performance, and lack of programs to analyze codes of beads. This dissertation describes the development process of the encoded bead-based multiplex assay platform to a level that can be used for actual diagnosis. Also, the results applied to Alzheimers dementia (AD) using the developed platform are described. In order to easily handle beads and reduce variations, it is necessary to impart magnetism to beads. However, commercial magnetic particles have ferromagnetism that retains a magnetism even in the absence of external magnetic fields. These magnetic particles form large lumps, and cannot make beads in uniform shape. To solve this problem, I developed a method for mass-synthesizing superparamagnetic nanoparticles. A system had been developed that can produce beads of a desired shape by illuminating ultraviolet rays reflected by a micro-mirror array onto a UV-curable polymer. This system has the advantage of providing various shapes of beads in real-time, but for using beads in actual diagnostic sites, it is necessary to develop a system capable of producing millions of beads within a short time. To increase production volume, I introduced a large-area exposure system used in semiconductor processes and solved problems arising from differences between photoresists used in semiconductors and polymers. As a result, I can increase the production capacity to 3.5 million per hour. In order to couple biomarkers on beads, suitable functional groups must be created on the surface of beads. In this dissertation, encoded beads were made by patterned UV and then coated with silica to increase stability. After that, amine and carboxylic acid were sequentially made on the surface of the beads. When amine modification was performed using commonly used material, performance variations occurred due to randomness during the reaction process and hydrolysis during the storage stage. To solve this problem, I introduced alternative material and optimized protocols utilizing its characteristics, and the variation in performance was reduced to less than 5%. I also developed a strategy for effectively assigning codes to beads, an automatic imaging device, and a decoding algorithm. I performed a comparative evaluation between the developed platform and the conventional method. The beads can be pre-coupled with probes in large quantities and used for long periods while ELISA requires attaching probes every test. The probe material required for one test can be saved about 100 times. When assuming testing ten biomarkers, the amounts of sample, antibody, fluorescent, and buffers were reduced in the developed multiplex platform by 30, 3, 20, and 15 times, respectively. Also, reaction time was halved due to the beads acting as a 3D suspension array. The developed platform has been applied to various clinics such as human papillomavirus (HPV), sexually transmitted infections (STIs), tuberculosis, sepsis, and Alzheimers disease (AD). This dissertation describes the application to dementia. Related biomarkers are changed decades before the onset of dementia. If these changes in biomarkers are detected in advance, the onset of dementia can be significantly delayed through treatment. The methods for diagnosing dementia are neuropsychological test, CSF check, and positron emission tomography (PET) imaging. A neuropsychological test is not possible for early diagnosis, and a CSF check is not suitable for routine tests due to the difficulty in collecting samples. PET imaging also has low accessibility due to its high cost. In this dissertation, I showed that dementia diagnosis is possible with about 80% accuracy by measuring multiple blood biomarkers and algorithmizing them.

드러난 증상이 같더라도 원인이 되는 질병은 다를 수 있다. 때문에 발현된 증상에 더하여 혈액, 객담, 소변과 같은 생체도래물질에 존재하는 바이오마커를 통한 진단이 많이 시행되고 있다. 기존 검사 방법인 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)과 같은 단일 분석 방법과 비교했을 때, 다중진단은 작업 흐름을 개선하고, 환자 샘플, 시약, 소모품, 검사 시간 등을 전반적으로 절약할 수 있다. 특히 환자 샘플의 사용량이 줄어든다는 점은 금전적 이익에 더하여 샘플 수집에 대한 부담을 줄임으로써 검사 접근성을 높일 수 있다는 장점이 있다. 또한 다수의 바이오마커를 조합함으로써 얻어지는 높은 정확도는 일상적인 검사를 통한 조기진단의 가능성을 높일 수 있다. 코드화된 미세입자를 활용한 다중진단 플랫폼에서는 미세입자에 부여된 코드에 따라 서로 다른 프로브를 붙이고, 수백 수천 개의 미세입자를 섞어서 환자 샘플과 반응시킨다. 환자 샘플과 반응이 이루어진 미세입자의 코드, 즉 프로브의 종류를 확인하면 환자의 바이오마커 정보를 알 수 있다. 해당 기술에 대한 개념에 대한 증명은 되어있었지만, 생산량의 부족, 생산 공정의 편차, 미세입자의 코드를 분석해줄 프로그램의 부재 등으로 인해 실제 진단시장에서 사용하기에는 부족한 상태였다. 본 논문에서는 코드화된 미세입자를 활용한 다중진단 플랫폼 기술을 실제 진단에 사용할 수 있는 수준으로 끌어올리는 개발과정을 기술하고, 개발한 플랫폼을 활용한 임상 결과 중 알츠하이머 치매에 적용한 결과를 서술한다. 생산 및 검사 과정에서 미세입자를 용이하게 다루고 반응의 편차를 줄이기 위해서는 미세입자에 자성을 부여해야 할 필요가 있다. 하지만, 상용 자성 입자는 외부 자력이 부재한 환경에서도 미세한 자력이 남아 있는 강자성 (ferromagnetic)을 띄고 있어 이를 활용할 경우 자성 입자들이 큰 덩어리를 형성함으로 인해 미세입자의 형태를 균일하게 만들 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위해 외부 자력이 인가되었을 때만 자성을 띄고 외부 자력이 부재할 때는 자성이 사라지는 초상자성 (superparamagnetic) 나노 입자를 대량으로 합성하는 방법을 개발하였다. 원하는 형태로 패턴을 변경할 수 있는 micro-mirror-array에 반사된 자외선을 자외선에 의해 경화 (polymerization)가 되는 폴리머에 쏘아 줌으로써 원하는 형태로 미세입자를 생산할 수 있는 시스템이 개발이 되어 있었다. 미세입자의 형태를 실시간으로 다양하게 부여할 수 있다는 장점이 있는 시스템이었지만, 실재 진단 현장에서 미세입자를 활용하기 위해서는 수천만 개의 미세입자를 단 시간 내에 생산할 수 있는 시스템 개발이 필요하였다. 생산량을 끌어올리기 위해 반도체 공정에서 사용되는 대면적 노광 시스템을 도입하였고, 반도체에서 사용하는 photoresist와 폴리머의 차이로 인해 발생하는 문제들을 해결하여 시간 당 생산량을 350만 개 이상으로 끌어올렸다. 미세입자에 바이오마커를 올리기 위해서는 적합한 작용기를 미세입자 표면에 만들어줘야 한다. 본 논문에서는 패턴 된 자외선으로 폴리머 입자의 형태를 만든 후, 실리카로 코팅하여 안정성을 높이고, 표면에 amine과 carboxylic acid를 순차적으로 올리는 방법을 고안하였다. 보편적으로 사용되는 APTES를 활용하여 amine처리를 하였을 때는 반응 과정의 무작위성 및 보관 과정에서의 가수분해로 인한 손실 문제로 인해 미세입자의 성능에 편차가 발생하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해 대체 물질을 도입하고, 해당 물질의 특성을 활용하는 프로토콜을 개발하여 미세입자의 성능 편차를 5% 이하로 낮췄다. 수 um 크기의 미세입자에 효과적으로 코드를 부여할 수 있는 방법을 개발하였고, 이를 분석할 수 있는 자동 촬영 장비 및 코드 해석 알고리즘을 개발함으로써 코드화된 미세입자를 활용한 다중진단 플랫폼을 완성하였다. 개발한 플랫폼에 대하여 기존 검사 방법인 ELISA와의 비교평가를 수행하였다. ELISA에서는 매 검사 마다 프로브를 붙이는 작업이 필요한 반면, 미세입자는 대량으로 프로브를 미리 붙여두고 장기간 사용할 수 있어 검사 준비 과정을 생략할 수 있었다. 한번의 검사에 필요한 프로브 물질의 양은 약 100배를 절약할 수 있었다. 10가지 바이오마커를 검사하는 것을 가정했을 때, 샘플의 양은 30배, 항체는 3배, 형광물질은 20배, 용매류는 15배 절약할 수 있었으며, 반응 시간도 절반으로 줄어들었다. 개발한 플랫폼은 자궁경부암, 성병, 결핵, 패혈증, 심혈관질환, 치매 등 다양한 임상에 활용되었으며, 본 논문에서는 해당 기술을 치매에 적용한 결과를 서술하였다. 치매는 임상적 증상이 발현하기 수십년 전부터 바이오마커에 변화가 일어난다. 이 바이오마커의 변화를 사전에 발견할 수 있다면 치료를 통해 치매의 발병을 유의미하게 늦출 수 있다. 기존에는 신경심리검사, 뇌척수액검사, PET 검사 등을 통해 치매를 진단하였는데, 신경심리검사는 조기진단이 불가능하고, 뇌척수액검사는 샘플 수집이 어려워 일상적인 검사에는 적합하지 않다. PET 검사 또한 비싼 검사비용으로 인해 접근성이 떨어진다. 본 논문에서는 혈액 내 여러 바이오마커를 측정하고 알고리즘화함으로써 약 80% 정확도로 치매 진단이 가능함을 보여주었다.