Studies on alleviating intestinal inflammation using probiotic potential of Saccharomyces cerevisiae GILA 118 and its cell wall component

Abstract

염증성 장 질환 (IBD)은 장관 내 만성 염증에 의해 일어난다고 알려져 있으며 궤양성 대장염과 크론병을 포함한다. IBD의 정확한 발병기전은 밝혀지지 않았으나 장 표피세포의 장벽 손상, 사이토카인 불균형 등이 염증성 장 질환을 일으키는 원인으로 보고되고 있다. 장상피에서 호중구 (neutrophils)가 활성화되면 TNF-α와 같은 염증성 사이토 카인이 방출된다. 크론병과 궤양성 대장염에서는 T helper (Th) 17의 분화가 유도되는데 이로 인해 조절 T 세포 (Treg)와 Th 17의 비율이 불균형해진다. 현재 염증성 장질환의 치료법으로는 일반적으로 항염증제와 항스테로이드, 면역조절제를 투약하는데 장기간 투약시 치료 효과가 감소하고 부작용 문제 또한 제기되었다. 따라서 보다 효율성과 안전성을 강구한 여러 연구에서 프로바이오틱스를 IBD 치료 전략으로 제안되었다. 하지만 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실러스 위주의 유용 원핵생물 위주로 연구가 진행되었고 진핵생물인 효모는 Saccharomyces boulardii (S. boulardii) 외에는 상대적으로 연구가 많이 진행되지 않았다. 이에 본 연구에서는 발효 및 식품 산업에 쓰이는 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 효모를 전통주인 막걸리로부터 분리하였고 S. boulardii를 비교 균주로 설정하여 분리된 효모와 장내 환경에서의 생존성을 기반으로 안정성, 장세포 부착성과 같은 프로바이오틱 특성에 근거하여 선발하였다. 마우스 대식세포 RAW 264.7에서 Nitric oxide (NO)와 마우스의 splenocyte에서 인터페론감마 (IFN)-γ 수치를 염증 유발 그룹보다 감소시키는 것을 확인하였다. ITS identification을 통해서 선발 효모가 S. cerevisiae strain인 것을 확인하였고, 장내 염증을 감소시킬 수 있는 잠재적인 프로바이오틱스로서 S. cerevisiae GILA 로 명명하였다. S. cerevisiae GILA를 1.5% dextran sulfate sodium (DDS)로 대장염을 유발한 마우스(C57BL/6J)에 처리하여 대장염 완화 효능을 확인하였다. S. cerevisiae GILA 중 특히 GILA118은 호중구 (neutrophils)의 활성화를 감소시키고 골수세포형과산화효소 (Myeloperoxidase, MPO)를 감소시켰다. 또한, 대장에서 밀착연접단백질 (tight junction protein, Occludin과 ZO-1)의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시켰으며 혈청에서는 IL-10의 유의적인 증가 및 TNF-α의 유의적인 감소가 나타났다. 이로서 S. cerevisiae GILA 118을 최종 선발하였다. 최종 선발된 S. cerevisiae GILA 118 세포벽 분리물을 제조 후 염증을 완화하는 효능을 마우스 대식세포 RAW 264.7과 일반 마우스 (C57BL/6J)를 통하여 검증하였다. GILA118를 산, 염기 분리법과 자이모레이즈 (Zymolyase)를 이용하여 세포벽 분리물을 제조하였다. 본 분리물은 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리한 대식세포 RAW 264.7과 DSS 1.5 % 급이로 유도한 IBD 마우스 모델을 이용하여 염증을 완화하는 기전을 확인하였다. RAW 264.7 cell에서 nitric oxide (NO) 발현 감소 및 PPAR-gamma gene expression을 통해 COX-2 gene expression 발현을 완화시켰으며, 마우스 혈청에서 IL-10이 DSS 유도 IBD 마우스보다 유의적으로 높아지는 세포벽 성분인 GILA118 PZ를 선발하였다. Treg 군집과 IL-17 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포의 군집의 비율을 비교해본 결과 전신 면역 조직인 비장에서 Treg 군집의 증가와 IL-17 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포의 비율이 감소하였다. 이후 생균과 세포벽 분리물 (PZ)의 처리군에서 장내 미생물총 조성이 안정화된 것을 확인하였다. 종합하면, 본 연구는 IBD를 완화하는 물질로 효모인 S. cerevisiae GILA를 분리하였고 GILA 118을 선발하여 세포벽 성분인 GILA 118 PZ를 제시하였다. 이는 향후 염증성 장질환의 완화와 관련 있는 프로바이오틱 특성을 가진 효모 및 효모의 세포벽에 대한 연구의 가능성을 시사한다.

Inflammatory bowel disease (IBD), including crohns disease (CD) and ulcerative colitis (UC), are idiopathic pathologies characterized by chronic and relapsing inflammation and mucosal tissue damage of the gastrointestinal tract (GIT). Although etiopathogenesis and the exact pathogenesis of IBD are unclear, the main factors of IBD have been considered the dysbiosis of intestinal microbiota, i.e., the disruption of normal composition in the gut microbiota and damage of epithelial cell integrity. When IBD occurs, epithelial migration of neutrophils and can activate pro-inflammatory cytokine such as TNF-α. CD, and UC-induced pro-inflammatory cytokine IL-17 producing CD4+ T cell-related Th17 cells to mediate the immune response. Thus, Th17 and Treg cells in IBD are imbalanced. Long-term drug therapy using sulfa pyridine could be avoided due to side effects. A common alternative treatment is probiotics. Recently, various probiotic products have been developed; however, most probiotic applications have only investigated the use of prokaryotic bacteria. Eukaryotic probiotics have not been as well studied except Saccharomyces boulardii. In the first study, the strain S. cerevisiae GILA 118 met the criteria for a probiotic which had alleviating inflammatory effect. Novel yeast strains were isolated from Korean fermented beverages and examined for their potential probiotic characteristics. Seven isolates showed auto-aggregation tendency, coaggregation with a pathogen, hydrophobicity with n-hexadecane, and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl scavenging effect similar to or higher than the control strain S. boulardii CNCM I-945. Nitric oxide production by S. cerevisiae's results were significantly lower than control. The selected isolates that showed promise as probiotics were identified as S. cerevisiae by internal transcribed spacer sequencing and results suggest that S. cerevisiae GILA could be potential probiotic strain. S. cerevisiae GILA strains were chosen by in vivo screening with 1.5 % dextran sulfate sodium-induced colitis murine model. Here, Saccharomyces cerevisiae GILA strains, particularly GILA118, down-regulate neutrophil, and myeloperoxidase. The expression levels of genes encoding tight junction proteins in the colon were upregulated, cytokine IL-10 was significantly increased, and TNF-α was reduced in the serum. In the second study, S. cerevisiae GILA 118s separate cell wall polysaccharide and protoplast were confirmed the alleviation of inflammation using murine macrophage RAW 264.7 cells, and C57B6/J mouse. S. cerevisiae GILA 118 cell wall polysaccharide and protoplast were used by NaOH/HCl separation technique and zymolyase. S. cerevisiae GILA 118 cell wall polysaccharide, protoplast verified the mechanism for alleviating intestinal inflammation in vitro and in vivo model. Nitric Oxide (NO) was reduced, COX-2 gene expression was reduced by PPAR-γ expression in RAW 264.7 cells, and S. cerevisiae GILA 118 cell wall polysaccharide treated with zymolyase (PZ), which IL-10 were significantly increased than DSS mouse model was selected. S. cerevisiae GILA 118 PZ induced the proportion of Treg cells and decreased the proportion of Th 17 cells in the spleen. GILA 118 and GILA 118 PZ also managed the gut microbiome to Thus, this study suggests that GILA118 and GILA118 cell wall components are potential alleviative agents in patients with IBD.