Bacterial communities and antimicrobial resistance profiling in on-farm dairy processing plants based on a metagenomic approach

Abstract

목장형 유가공장은 농장과 유가공장이 가까이 위치해 있기 때문에 농장 및 유가공장 환경 위생이 유가공품 가공 과정에 영향을 줄 수 있다. 이러한 목장형 유가공장은 주로 소규모로 운영되고 저온살균 방법을 통해 원유를 가공한다. 이와 같은 특징 때문에 직·간접적인 접촉을 통해 농장에서 유가공장으로 미생물 유입이 일어날 수 있으며 이는 유가공품의 품질 저하에 영향을 미칠 수 있다. 특히 젖소 농장 및 유가공장에서 항생제 내성균이 보고되고 있으며 이는 유가공품에 유입 시 유가공품 섭취를 통해 인체에 전달될 가능성이 있다. 본 연구는 목장형 유가공장의 농장 단계, 살균 전 단계, 살균 후 단계, 유가공장 환경 단계에서의 미생물 분포와 미생물 군집의 항생제 내성을 조사하고자 하였다. 미생물 분포는 지표세균 오염의 정량화 및 메타지놈 분석을 통해 확인하였다. 또한, 목장형 유가공장의 각 단계 샘플에서 분리한 세균의 다양한 항생제에 대한 내성 표현형을 확인하고 분리주와 메타지놈에서의 항생제 내성 유전자 분포를 확인하여 목장형 유가공장의 미생물 군집에서의 항생제 내성균 분포를 파악하였다. 배양 의존적 방법에 의한 분석 결과 지표세균은 목장형 유가공장의 전 단계에 분포하고 있었다. 호기성 세균은 농장 단계에서 0.70 ~ 5.90 log CFU/mL, 살균 전 단계에 2.17~8.89 log CFU/mL가 분포하고 있었으며 살균 후에는 0.20~3.97 log CFU/mL로 유의하게 감소하였다. 대장균군의 경우 농장 단계에 0.30 ~4.60 log CFU/mL, 살균 전 단계에 0.60 ~ 5.39 log CFU/mL가 분포하고 있었으며 살균 후에 0.40~0.90 log CFU/mL로 유의하게 감소했다. 하지만 최종 유가공품에서 호기성 세균과 대장균군의 오염도가 각각 0.18~8.54 log CFU/mL, 0.18~5.23 log CFU/mL로 증가하였고 이는 살균 후 단계에서 유가공장 환경과의 교차오염이 일어나고 있을 가능성을 의미한다. 메타지놈 분석을 기반으로 한 배양 비의존적 방법에 의한 분석에서는 대표적인 저온성 세균으로 알려진 Pseudomonas의 상대적 분포가 농장 단계 (24.1%) 와 살균 전 단계 (65.9%)에서 모두 우세하게 확인되었는데 이는 목장형 유가공장에서 농장에서 유가공장으로 미생물 유입이 일어날 수 있음을 의미한다. 살균 후에도 Pseudomonas를 포함한 다른 저온성 세균 (Acinetobacter, Enterobacteriaceae)의 분포가 여전히 우세하였고 이는 이들이 살균에 저항하여 생존하였을 가능성을 나타낸다. 핵심 미생물군 분석에서는 농장 단계에서 126개, 살균 전 단계에서 132개, 살균 후 단계에서 105개의 속이 확인되었는데 이 중 74개의 속이 목장형 유가공장 전 단계에 공통적으로 분포하고 있었으며 13개 속이 저온성 세균에 해당하였다. 목장형 유가공장의 각 단계 샘플에서 총 59 균주가 분리되었으며 이 중 Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., and Enterobacter spp., Citrobacter spp., Kluyvera spp., Hafnia spp., Buttiauxella spp., Raoultella spp., Serratia spp., Lelliottia spp., Klebsiella spp., Pantoea spp.를 포함한 49 균주가 저온성 세균으로 확인되었다. 항생제 내성 분석 결과, 59 균주 중 44 균주 (74.6%)가 한 개 이상의 항생제에 내성 표현형을 보였다. FOX, AMP, AMC, TIC에 내성을 지니는 균주는 목장형 유가공장의 전 단계에 분포하고 있었다. 특히 같은 항생제 내성 패턴을 지니는 균주가 같은 농장, 같은 계절의 연속적인 단계에 분포하는 것이 확인되었다. 나아가 59균주 중 16 균주는 (27.1%) 플라스미드를 매개로 전달되는 항생제 내성 유전자 (blaCTX-M-1, blaSHV, blaTEM, aac(3)-Ⅱ, aac(3)-Ⅳ, and tet A)를 지니고 있는 것이 확인되었으며 이는 이들이 잠재적으로 다른 세균에 항생제 내성 유전자를 전달할 가능성이 있음을 의미한다. 항생제 내성 유전자를 보유하는 균주가 분리되지 않은 샘플의 메타지놈에서도 해당 유전자가 검출되었고 이를 통해 분리되지 않은 균도 항생제 내성 유전자를 보유하는 것을 확인하였다. 이러한 항생제 내성 유전자의 분포는 목장형 유가공장의 전 단계에서 모두 확인되었다. 이러한 연구 결과는 목장형 유가공장 전체에 항생제 내성 저온성 세균이 지속적으로 분포 및 확산될 가능성이 있고 잠재적으로 최종 유가공품에 유입되어 인간 건강에 위협이 될 수 있음을 시사한다. 또한, 본 연구 결과는 항생제 내성 저온성 세균의 분포를 파악하는데 분리·배양법과 유전자 검색에 의한 분석법의 적용에 대한 중요성을 제시하였다.

On-farm dairy processing plants have a structure in which the farm and the dairy processing plants are in proximity, so that environmental hygiene of farm and dairy plants may affect the dairy processing stages. Unlike general dairy processing plants, these on-farm dairy processing plants are generally operated on a small scale and produce dairy products through LTLT pasteurization. Attributed to these characteristics, microorganisms can enter the dairy supply chain in on-farm processing plants through direct and indirect contact between farms and dairy processing plants. In particular, antimicrobial-resistant bacteria have been reported in dairy farms and their introduction to dairy products can pose a risk to human health as they can transfer the resistance to their gut microbiota. The objective of this study is to investigate the microbial distribution and antimicrobial resistance of bacterial community at the four dairy processing stages (farm, pre-pasteurization, post-pasteurization, and dairy processing environments stages) of on-farm dairy processing plants. Microbial distribution was investigated by quantification of indicator bacteria contamination and metagenomic analysis. Moreover, the antimicrobial resistance of bacteria communities in on-farm dairy processing plants was investigated by identifying the resistance phenotype of bacterial isolates and detecting antimicrobial resistance genes in bacterial isolates and metagenome. In culture-dependent approach, indicator bacteria were distributed at all stages of on-farm dairy processing plants. The contamination level of aerobic microbes ranged from 0.70 to 5.90 log CFU/mL at the farm stage, 2.17 to 8.89 log CFU/mL at pre-pasteurization stage, and significantly decreased to 0.20 to 3.97 log CFU/mL after pasteurization. In addition, the contamination level of coliforms ranged from 0.30 to 4.60 log CFU/mL at the farm stage, 0.60 to 5.39 log CFU/mL at pre-pasteurization stage, and significantly decreased to 0.40 to 0.90 log CFU/mL after pasteurization. However, the contamination level of aerobic microbes and coliforms in the final dairy product increased significantly to 0.18 to 8.54 log CFU/mL and 0.18 to 5.23 log CFU/mL, respectively, compared to pasteurized milk, indicating the possibility of cross-contamination with the dairy plant environment at the post-pasteurization stage. In culture-independent approach based on metagenomic analysis, the relative abundance of Pseudomonas, the representative psychrotrophic bacteria, was identified the most at both the farm stage (24.1%) and pre-pasteurization stage (65.9%), indicating the possibility of microbial introduction from farm to dairy processing plants. Pseudomonas and other psychrotrophic bacteria such as Acinetobacter and Enterobacteriaceae were still dominant at the post-pasteurization stage, indicating their survival from pasteurization. In core microbiota analysis, 126 genera were distributed at farm stage, while 132 and 105 genera were distributing at pre-pasteurization stage and post-pasteurization, respectively. Among them, 74 genera were distributed at all stages and 13 of them were psychrotrophic bacteria. In culture-dependent analysis, 59 strains were isolated from on-farm dairy processing plants and 49 of them including Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., and Enterobacter spp., Citrobacter spp., Kluyvera spp., Hafnia spp., Buttiauxella spp., Raoultella spp., Serratia spp., Lelliottia spp., Klebsiella spp., Pantoea spp., were identified as psychrotrophic bacteria. In results of antimicrobial resistance analysis, 44 of 59 (74.6%) were resistant to at least one antimicrobial agents. FOX-, AMP-, AMC-, and TIC-resistant bacteria were distributed at all stages of on-farm dairy processing plants. In particular, bacterial isolates showing the same AMR pattern were distributed at serial stages of same farms and seasons, indicating the transmission of antimicrobial-resistant bacteria according to processing stages. Moreover, 16 of 59 (27.1%) isolates carried plasmid mediated-antimicrobial resistance genes (blaCTX-M-1, blaSHV, blaTEM, aac(3)-Ⅱ, aac(3)-Ⅳ, and tet A), which can be potentially transferred to other bacteria. These genes were also detected in the metagenome of samples from which the corresponding isolates was not isolated, indicating the distribution of antimicrobial resistance genes in uncultured bacteria as well. The distribution of these antimicrobial resistance gene was found at all stages of on-farm dairy processing plants. These results suggest that antimicrobial-resistant psychrotrophic bacteria may spread and persist in entire on-farm dairy processing plants. They could potentially enter final dairy products and pose a threat to human health. Additionally, this suggests the importance of applying both culture-dependent and culture-independent approaches to identify the distribution of antimicrobial-resistant psychrotrophic bacteria.