Neuroprotective and immunomodulatory effects of superoxide dismutase in SH-SY5Y neuroblastoma cells and RAW 264.7 macrophage cells

Abstract

초과산화물불균등화효소(superoxide dismutase, SOD)는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)로부터 몸을 보호하는 항산화 효소이다. 이는 항산화 효과뿐만 아니라 대식세포에서 면역조절 특성을 가지고 있다고 보고되었다. 대식세포는 선천성 면역반응의 주요 매개자이며, 염증을 유발하는 M1 대식세포와 염증을 억제하는 M2 대식세포의 형태로 나뉜다. 그리고 SOD는 대식세포의 M1에서 M2로의 분극을 유도하는 면역조절 특성을 가지고 있다고 알려졌다. 이 연구의 목적은 신경세포에서 SOD의 항산화 및 신경 보호 효과를 확인하는 것뿐만 아니라 대식세포에서 SOD의 면역 조절 능력을 평가하는 것이었다. 신경세포(SH-SY5Y)와 대식세포(RAW 264.7)에서 SOD의 세포독성을 평가하기 위해 다양한 농도의 SOD를 배양된 세포에 처리한 후 세포 계수 키트(CCK)-8을 통해 분석을 진행하였다. 실험결과 신경세포에서는 SOD의 농도가 10M을 넘어설 때 세포생존율이 1.13배 감소하였으며(P<0.001), 대식세포에서는 SOD의 농도에 따른 세포생존율이 차이가 확인되지 않았다. 따라서 실험은 SOD가 신경세포, 대식세포의 세포생존율에 영향을 주지 않았던 1M의 농도에서 진행되었다. SOD의 항산화 효과를 평가하기 위해 우선 배양한 신경세포에 H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유발한 후 SOD 처리 유무에 따른 활성산소종의 축적 정도 및 세포생존율의 변화를 각각 H2DCFDA 염색법과 세포 계수 키트-8을 통해 평가하였다. SOD를 신경세포에 같이 처리한 경우 처리하지 않은 경우에 비하여 활성산소종의 축적을 5.5배 억제하였고(P<0.001) 세포 생존율을 1.15배 향상시켰다(P<0.05). 또한 대식세포에 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 염증을 유발한 뒤 얻은 조건화 배양액을 신경세포에 처리하였을 때 괴사되는 정도를 annexin V 염색을 통해 평가하였고, SOD를 조건화 배양액과 같이 처리한 경우 괴사되는 정도가 1.56배 감소하였다(P<0.05). 그리고 SOD의 면역조절 능력을 평가하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 실험을 진행하였고, LPS를 처리하여 염증을 유발한 대식세포에 SOD를 처리하는 경우 M1 분극과 관련된 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 사이토카인들이 감소하는 것을 확인하였다(IL-1β, 3배, P<0.001; IL-6, 8.57배, P<0.001; TNF-α, 20.15배, P <0.001). 이 결과를 통해 대식세포에서 SOD가 M1에서 M2로의 전이를 유도하는 것을 확인하였다. 이 연구를 통하여 SOD의 항산화효과 뿐만 아니라 염증상황에서 신경세포를 보호하는 효과를 확인할 수 있었고, 대식세포에 적용했을 때 염증성 M1에서 항염증성 M2로의 전이를 유도하는 면역조절 능력도 확인할 수 있었다. 비록 세포 수준에서 확인한 효과로 더 많은 후속 연구가 필요할 것으로 보이지만, 본 연구의 결과는 수의임상에서 원인불명의 비감염성 뇌수막염을 비롯한 다양한 염증성 신경계 질환의 치료제로서 SOD가 적용될 수 있는 가능성을 보여주었다.

Superoxide dismutase (SOD) is an antioxidant enzyme that protects the body from free radicals. It has been reported to have both antioxidant and immunomodulatory properties. Macrophages are key mediators of the innate immune response and are divided into the pro-inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 subtypes. And SOD is known to have immunomodulatory effects that cause macrophages to polarize from M1 to M2. The purpose of this study was to assess the antioxidant and neuroprotective effects of SOD in nerve cells, as well as its immunomodulatory ability in macrophages. In order to assess cytotoxicity against SOD, nerve cells (SH-SY5Y) and macrophages (RAW 264.7) were treated with varying concentrations of SOD and then analyzed using the cell counting kit (CCK)-8 assay. When the concentration of SOD exceeded 10 μM in nerve cells, cell viability decreased (1.13-fold, P<0.001), whereas the viability of macrophages was not affected by SOD concentrations. Therefore, the study was conducted at a SOD concentration of 1 μM, at which it is known to be non-cytotoxic to both cell lines. To determine the antioxidant effect of SOD, H2O2 was treated to induce oxidative damage in cultured nerve cells. Subsequently, alterations in reactive oxygen species (ROS) accumulation and cell viability were determined using H2DCFDA staining and cell CCK-8 assay, respectively. When nerve cells were treated with H2O2, SOD inhibited the accumulation of ROS (5.5-fold, P<0.001) and enhanced cell viability (1.15-fold, P<0.05). In addition, the degree of necrosis was assessed using annexin V staining when nerve cells were treated with conditioned medium obtained after treating macrophages with lipopolysaccharide (LPS) to induce inflammation. The degree of necrosis was reduced when SOD was treated with conditioned medium (1.56-fold, P<0.05). In addition, quantitative real-time PCR was performed to assess the immunomodulating ability of SOD, and it was confirmed that cytokines related to M1 polarization decreased when SOD was applied to inflammatory macrophages treated by LPS (IL-1β, threefold, P<0.001; IL-6, 8.57-fold, P<0.001; TNF-α, 20.15-fold, P<0.001). It was confirmed by these result that SOD induces M1 to M2 transition in macrophages. This study confirmed not only the antioxidant effect of SOD, but also its ability to protect nerve cells in inflammatory situations and to induce the transition of inflammatory M1 to anti-inflammatory M2 when applied to macrophages. In veterinary clinical medicine, SOD has the potential to be used as a treatment option for a variety of neurological diseases, including noninfectious meningoencephalitis of unknown etiology, based on the findings of this study. However, since this study was conducted at the cellular level, additional research seems to be needed.