CRISPR/Cas9-mediated Lung Organoid Modeling of Ciliary Dyskinesia

Abstract

Lung is the organ that inhale external air for gas exchange, causing continuous exposure to foreign substances. Therefore, various defense mechanisms that remove them have been developed. Mucociliary clearance is one of the importance defense mechanisms to remove relatively large particles deposited on airway. The synchronized motion of cilia on apical side of ciliated cells on airway plays a key role on this mechanism. When genes involved in cilia composition or assembly have defects, primary ciliary dyskinesia (PCD) occurs. The acquired dyskinesia can also occur when ciliary movement decreases due to chronic inflammation or repeated infections. However, research on ciliary movement is limited, and genomic studies using genetic perturbation have been conducted only with animal models, primarily due to the fact that ciliated cells are fully differentiated cells, so that it cannot be studied using cell lines. Primary cell cultures, which cannot be cultured long-term, are also not suitable for gene editing study. In addition, there have been difficulties in measuring ciliary beating frequency (CBF) using the conventional methods since cilia move together and images of cilia can be easily overlapped for each other.

To address these issues, during this doctoral program, (1) lung organoids that can be cultured long-term were established using patient samples, and it was confirmed that ciliated cells were induced well enough. (2) A novel CBF measurement technique was jointly developed to evaluate the spatial distribution of ciliary movement in the organoids quickly and accurately. (3) The variant with unknown significance discovered through whole-exome sequencing of a PCD family was introduced in normal airway organoids and it is confirmed that the variant causes ciliary dyskinesia.

Through this study, the CRISPR/Cas9-mediated organoid model was established, enabling functional validation of various PCD-causing variants and laying the foundation for future correction through editing, as well as demonstrating the potential for extension to acquired dyskinesia.

폐는 외부 공기를 흡입하여 가스 교환을 하는 장기이므로, 필연적으로 외부 물질에 노출된다. 이에 따라, 흡입된 이물질을 제거하기 위한 다양한 방어 기전이 존재한다. 그 중 하나인 핵심적인 세포 소기관인 섬모 (cilium)는 기도의 섬모 세포 (ciliated cell)에 존재하며 서로 동기화된 움직임을 통해 기도에 침착한 이물질을 외부로 밀어낸다. 따라서, 섬모를 구성하거나 조립에 관여하는 유전자 중 하나에 이상이 생기면 유전질환인 일차성 섬모운동장애 (primary ciliary dyskinesia; 이하 PCD)가 발생한다. 또한, 만성 염증이나 반복적인 감염으로 인해 기관지 상피 세포가 손상되면, 다양한 만성 폐질환에서 획득성 섬모운동장애 (acquired ciliary dyskinesia)가 발생하기도 한다. 그럼에도, 여러 가지 이유로 섬모 운동에 대한 연구는 제한적이었다. 우선, 섬모 세포는 분화된 세포이고 분열하지 않기 때문에, 세포주가 따로 존재하지 않아 이를 이용한 연구가 불가능하며 주로 동물 모델이 이용되어왔다. 사람 조직에서 얻은 섬모 세포를 일시적으로 배양하는 일차 세포 배양 (primary cell culture)이 섬모 연구에 널리 쓰이고 있으나, 장기간 배양이 불가능하므로, 유전자 편집 연구에는 적합하지 않다. 또한, 기존 섬모 운동을 측정하는 시간과 노력이 많이 들면서도 편향이 발생하기 쉬우면서 부정확할 때가 있는데, 섬모들은 함께 움직이며 섬모 이미지가 겹쳐보이기 쉽기 때문이다.

박사 학위 기간동안 이를 해결하기 위해 여러 가지 접근을 수행하였다. (1) 호흡기 환자 샘플, 특히 기관지 내시경 브러싱 샘플을 이용하여 사람 폐 오가노이드를 수립하였으며, 섬모 세포를 비롯하여 기관지를 구성하는 세포들이 잘 유도됨을 확인하였다. (2) 공동 연구를 통해 새로운 섬모 운동 측정하는 방법을 개발하였으며, 이를 통해 오가노이드 내 다양하게 존재하는 섬모 운동을 빠르고 정확하게 평가할 수 있게 되었다. (3) PCD 환자 가족의 전장 유전체 염기서열 분석 (whole genome sequencing)에서 발견된 기능을 정확히 알 수 없는 돌연변이를 CRISPR/Cas9 시스템으로 정상 폐 오가노이드에 도입하였고, 이 돌연변이가 섬모 운동 이상을 유발하는 것을 확인하였다.

이번 연구를 통해, CRISPR/Cas9 기반의 사람 폐 오가노이드 유래 섬모 운동 연구 모델이 확립되었다. 이를 통해 PCD 유발하는 다양한 변이들의 기능적 검증이 가능 해졌으며, 향후 돌연변이 교정을 위한 유전자 편집을 위한 기반을 마련하였고, 만성 폐질환으로 인한 획득성 섬모운동장애 연구로의 확장 가능성도 보여주었다.