Effects of Bioactive Whitlockite-Based Biomaterials on Bone Regeneration in Bone Defect and Osteonecrosis Models

Abstract

Background: Whitlockite (WH: Ca18Mg2(HPO4)2(PO4)12) has outstanding advantages and potential as a new bio-ceramic. Compared with Calcium phosphate-based ceramics, WH is of great significance in bone tissue regeneration engineering because its chemical composition contains magnesium ions in addition to calcium and phosphate ions. In previous studies, WH showed better osteoconductivity and osseointegration than hydroxyapatite (HAP) and tricalcium phosphate (TCP), and it was more effective in promoting bone regeneration. However, preclinical studies to demonstrate the potential clinical value of WH ceramic materials and biomaterials based on them are still lacking. Therefore, this study aims to design and fabricate WH-based biomaterials for specific bone diseases, reveal their biological properties, and verify the application value and potential as new bioceramics and biomaterials through in vitro and in vivo experiments. Methods: This study designed and fabricated two types of WH-based customized biomaterials for clinically common bone disease (osteoporotic vertebral compression fracture and osteonecrosis of the femoral head). That is WH-incorporated functional bone cement (Part 1) and antioxidant-coated multifunctional WH scaffold (Part 2). In part 1, Tetracalcium phosphate (TTCP) and WH were incorporated with Polymethyl methacrylate (PMMA) bone cement to prepare a novel functional bone cement (TTCP/WH) and systemically evaluated its characteristics such as the operational working time and mechanical properties, etc., and compared with the International Standardization Organization standard (ISO 5833). And the biocompatibility, osteoconductivity, and osseointegration ability were evaluated through in vitro and in vivo studies. In part 2. First, following the Preferred Reporting Items for Systemic Reviews and Meta-analyses for Network Meta-analysis (PRISMA-NMA) reporting guideline, statistical analysis was performed on various early treatment methods for femoral head necrosis to evaluate their effectiveness. Then, the scaffold was designed and fabricated to treat femoral head necrosis using the tyrosinase immobilized glass bead (ImTYR) system as an antioxidant multifunctional whitlockite (WH) scaffold. Its physicochemical properties were systematically evaluated, and its biological properties were evaluated by in vitro study and animal experiments in a steroid-induced rabbit femoral head necrosis model. Results: In part 1, The TTCP/WH bone cement conformed to the ISO 5833 standard and showed a lower Youngs modulus and suitable operational working time and physical properties for clinical use than conventional polymethylmethacrylate (PMMA). In vitro experiments showed that TTCP/WH bone cement exhibits good biocompatibility and osteogenic activity and improved expression of genes related to bone formation compared to the PMMA. and in rabbit ilium bone defect study, it showed stronger bone regeneration ability and osseointegration ability. In part 2. Results of the Network meta-analysis showed no statistical difference in the outcome of radiographic progression and conversion to total hip arthroplasty (THA), also in Harris Hip Score (HHS), other than core decompression(CD)+cell therapy showed relatively superior results in radiographic progression than nonsurgical treatment. And the osteoconductive scaffold containing WH was coated with antioxidant HA_CQ using the ImTYR system which provided a stable and safe method for coating medical devices with tyrosinase base reaction. In vitro experiments showed that WH and WH_CQ improved the osteogenic activity effect on human bone marrow stem cells(hBMSC) and the expression of genes related to bone formation compared to the control or collagen groups. In the steroid-induced osteonecrosis of femoral head(ONFH) rabbit model, WH and WH_CQ showed more distinct bone regeneration and microvascular regeneration capabilities than simple decompression, and a certain level of osteoclast inhibition. In addition, the WH_CQ group was found to have a positive effect on delaying the progression of osteonecrotic disease by reducing reactive oxygen species(ROS) and pro-inflammatory cytokine expression. Conclusions: TTCP/WH functional bone cement is expected to be a better choice for the treatment of osteoporotic vertebral compression fractures in the future due to its excellent biocompatibility, bone conductivity, and ability to promote bone formation. Antioxidant-coated multifunctional whitlockite scaffold possesses the unique biological properties of WH, so it has excellent bone regeneration ability, promotes the microvascular generation, and reduces ROS and pro-inflammation cytokine expression. It is expected to be a new idea and method for early treatment of the femoral head in the future. The results of this study provide a deeper understanding and experimental basis for whitlockite ceramic-based biomaterials and are expected to be widely used in the medical field in the future.

서론: 휘트로카이트(Whitlockite: Ca18Mg2(HPO4)2(PO4)12, WH)는 새로운 바이오세라믹으로서 뛰어난 장점과 가능성을 가지고 있다. 인산칼슘계 세라믹과 비교하여 WH는 화학적 조성에 칼슘, 인산이온 외에 마그네슘 이온이 포함되어 있기 때문에 골조직 재생 공학에서 더 우수한 골 재생 효과를 가지고 있다. 기존 연구에서 휘트로카이트는 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite:HAP) 및 삼인산화칼슙(Tricalcium phosphate:TCP)보다 우수한 골전도성 및 골유착성을 보였고, 골 재생 촉진에 더 효과적이었다. 그러나 WH 세라믹 소재와 이를 기반으로 한 생체소재의 잠재적인 임상적 가치를 입증하기에는 전임상 연구가 아직 많이 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 특정 골질환에 대한 WH 기반 생체재료를 디자인 및 제작하고, 그의 생물학적 특성 밝히고, in vitro 및 in vivo 실험을 통해 새로운 바이오세라믹 및 생체재료로서의 응용가치와 가능성을 검증하는데 목적이 있다. 방법: 본 연구에서는 임상적으로 흔한 골질환(골다공증성 척추압박골절 및 대퇴골두 괴사)을 위해 두 가지 유형의 휘트로카이트 기반 맞춤형 생체 재료(즉 휘트로카이트 함유된 기능성 골시멘트(1부)와 항산화 코팅된 다기능 휘트로카이트 지지체(2부))를 디자인 및 제작하였다. 1부에서는 사인산칼슘(TTCP)과 휘트로카이트를 기존 PMMA 골 시멘트와 혼합하여 새로운 기능성 골시멘트를 제작하였고 그에 대한 기계적 물성, 작업 가능한 시간 등 특성에 대해 국제 표준화 기구 규격(ISO 5833)을 참고로 하여 체계적으로 평가분석 하였다. 그리고 생체 외 및 생체 내 연구를 통해 생체적합성, 골전도성, 골유합 능력을 평가하였다. 2부에서는 먼저 PRISMA-NMA(Preferred Reporting Items for Systemic Reviews and Meta-analysiss for Network Meta-analysis) 보고 가이드라인에 따라 대퇴골두 괴사에 대한 다양한 조기 치료방법에 대한 통계 분석을 수행하여 그 유효성을 평가 분석하였다. 그런 다음 ImTYR(tyrosinase immobilized glass bead) 시스템을 사용하여 대퇴골두 괴사를 치료하기 위한 항산화제 다기능 휘트로카이트 지지체를 디자인 및 제작하였다. 그리고 생체재료의 물리화학적 특성을 체계적으로 평가하였고 생체 외 연구 및 스테로이드 유도 토끼 대퇴골두 괴사 모델에서의 생체 내 연구를 통해 생물학적 특성을 평가하였다. 결과: 1 부: TTCP/WH 골 시멘트는 ISO 5833 표준에 부합하였고 임상에서 사용하기 적합한 작업 시간을 보였으며, 기존 PMMA보다 Youngs modulus가 낮았다. In vitro 실험에서는 TTCP/WH 골 시멘트는 PMMA에 비해 양호한 생체적합성과 골 형성 활성 및 골 형성 관련 유전자 발현이 향상된 것으로 나타났다. 또한 토끼 장골 결손 연구에서는 보다 뚜렷한 골 재생 능력과 골 유착 능력을 보였다. 2 부: 네트워크 메타분석 결과 대퇴골두 괴사에서 방사선학적 진행(radiographic progression), 고관절 전치환술(THA)로의 전환 및 Harris Hip Score(HHS) 값에서는 기존 조기 치료법들이 통계적으로 차이가 없었다. 다만 핵심 감압술+세포치료법이 방사선학전 진행 결과에서 상대적으로 보다 좋은 결과를 보였다. WH를 포함하는 골전도 지지체는 ImTYR 시스템을 사용하여 항산화제 HA_CQ로 코팅 되었다. In vitro 연구에서는 WH와 WH_CQ는 hBMSC 세포에 대한 골 형성 활성 효과와 관련 유전자의 발현을 대조군이나 콜라겐 그룹에 비해 향상시키는 것으로 나타났다. 스테로이드를 투여한 ONFH 토끼 모델에서 WH와 WH_CQ는 단순 감압술 보다 더 뚜렷한 골 재생 및 미세혈관 재생 능력을 보였고, 파골세포를 억제하는 것이 확인되었다. 뿐만 아니라 WH_CQ군은 기타 군과 비교 시 ROS 감소 효과 그리고 전 염증 사이토카인 발현(pro-inflammation cytokine expression)을 감소시키는 작용을 관찰할 수 있었으며 이는 골 괴사 질병 진행 지연에 긍정적인 영향을 주는 것으로 나타났다 결론: TTCP/WH 기능성 골 시멘트는 우수한 생체적합성과 골 전도성 그리고 골 형성 촉진 능력으로 추후 골다공성 척추 압박 골절을 치료함에 있어서 보다 좋은 생체재료로서 활용이 기대된다. 항산화 코팅된 다기능 휘트로카이트 스캐폴드는 WH의 고유한 생물학적 특성을 보유해 골 재생 능력이 뛰어나고 미세혈관 생성 촉진 작용과 더불어 ROS 감소 및 전 염증 사이토카인 발현(pro-inflammation cytokine expression) 감소 효과를 보이고 있어 이는 향후 조기 대퇴골두 괴사의 치료에 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구의 결과는 WH 세라믹 기반 생체재료에 대한 더 깊은 이해와 실험적 기초를 제공하는데 의의가 있으며, WH는 추후 의학 영역에 광범위하게 사용될 것으로 예상된다.