Effects of mTOR inhibitor administration for attenuation of cyclophosphamide-induced ovarian damage in a mouse model

Abstract

AIM: To investigate if pre-treatment with everolimus or rapamycin could prevent cyclophosphamide (Cp)-induced ovarian follicle damage in mice. METHODS: A total of 120 BDF-1 female mice were randomly divided into four groups (30 mice per group) according to specific treatment. In the Control Group, normal saline (0.1 mL) was injected on Day 1 (D1), D3, D5, and D13. In the Cp Group, normal saline (0.1 mL) was injected one D1, D3, and D5 and Cp (75 mg/kg) was injected on D13. In the Everolimus + Cp Group, everolimus (0.75 mg/kg) was injected on D1, D3, and D5 and Cp was injected on D13. In the Rapamycin + Cp Group, rapamycin (4.0 mg/kg) was injected on D1, D3, and D5 and Cp was injected on D13. On D20, all mice were euthanized to recover ovaries. Ovarian samples were processed for ovarian histology. In addition, protein expression levels of BCL-xL (anti-apoptotic marker), Caspase 3 (apoptotic marker), and mTOR were assessed quantitatively by Western blot analysis. RESULTS: The number of primordial follicles in the Cp Group was significantly lower than that in the Control Group (median: 8 vs. 22, p = 0.001). The Everolimus + Cp Group (11.5 vs. 22, p = 0.001) and the Rapamycin + Cp Group (8.5 vs. 22, p = 0.003) also showed significantly lower numbers of primordial follicles than the Control Group. In all four groups, there was no significant difference in the proportion of G1 primordial or G1 secondary follicles. Compared with the Control Group, the Cp Group and the Everolimus + Cp Group showed significantly lower proportions of G1 primary follicles. However, the Rapamycin + Cp group (64.1% ± 3.3%) showed a proportion of G1 primary follicles similar to that in the Control Group (62.5% ± 3.2%). The Cp Group, Everolimus + Cp Group, and Rapamycin + Cp Group showed significantly lower proportions of G1 antral follicles than the Control Group. However, intra-ovarian protein expression levels of BCL-XL, Caspase 3, and mTOR were not significantly different among the four groups. CONCLUSION: Pretreatment with rapamycin did preserve the proportion of G1 primary follicles. However, pretreatment with everolimus or rapamycin did not preserve the number of primordial follicles.

목적: 본 연구에서는 시클로포스파미드를 투여하기 전 mTOR 억제제인 에베로리무스 또는 라파마이신 처리가 난소 난포 손상을 보호할 수 있는지 평가하고자 하였다. 방법: 총 120마리의 BDF-1 마우스를 무작위로 4개 그룹으로 나누었다 (각 그룹 30마리). 대조군은 생리식염수 0.1 mL를 D1/D3/D5/D13에 주사하였다. 시클로포스파미드 군은 생리식염수 0.1 mL를 D1/D3/D5에, 그리고 시클로포스파미드 75 mg/kg를 D13에 투여하였다. 에베로리무스 + 시클로포스파미드 군은 에베로리무스 0.75 mg/kg를 D1/D3/D5에, 그리고 시클로포스파미드를 D13에 투여하였다. 라파마이신 + 시클로포스파미드 군은 라파마이신 4.0 mg/kg을 D1/D3/D5에, 그리고 시클로포스파미드를 D13에 투여하였다. 모든 마우스는 D20에 안락사하여 난소를 적출하였고, 난소 난포수를 확인하기 위하여 H&E 염색을 시행하였다. 일부 난소는 BCL-XL (항세포사멸 표지자), Caspase 3 (세포사멸 표지자) 및 mTOR 단백질 발현을 보고자 웨스턴 (western blot) 정량적 분석을 시행하였다. 결과: 시클로포스파미드 군은 대조군에 비하여 원시난포수가 유의하게 낮았다 (8 대 22, p = 0.001). 에베로리무스 + 시클로포스파미드 군 (11.5 vs. 22, p=0.001), 라파마이신 + 시클로포스파미드 군에서도 (8.5 vs. 22, p=0.003) 대조군에 비하여 원시난포수가 유의하게 낮았다. 원시난포수는 시클로포스파미드 군, 에베로리무스 + 시클로포스파미드 군, 라파마이신 + 시클로포스파미드 군에서 차이가 없었다. 일차난포수, 이차난포수 및 동난포수는 네 군에서 차이가 없었다. 원시난포의 G1 비율과 이차난포의 G1 비율은 네 군에서 차이가 없었다. 일차난포의 G1 비율은 시클로포스파미드 군 및 에베로리무스 + 시클로포스파미드 군에서 대조군에 비해 감소하였으나 라파마이신 + 시클로포스파미드 군에서는 대조군과 비슷한 수치를 보여 일차난포의 G1 비율이 잘 유지되었다. 동난포의 G1 비율은 시클로포스파미드 군, 에베로리무스 + 시클로포스파미드 군 및 라파마이신 + 시클로포스파미드 군 모두 대조군에 비해 감소하였다. 난소내 BCL-XL, Caspase 3 및 mTOR 단백질 발현 수준은 네 군에서 차이가 없었다. 결론: 에베로리무스와 라파마이신 전처치는 원시난포수 보존에 효과를 보이지는 않았지만 라파마이신 전처치는 일차난포의 G1 비율 보존에 효과적이었다.