Anti-cancer effects of genipin in human oral squamous cell carcinoma by inhibiting STAT3 signaling

Abstract

Background: Genipin, which is a natural compound derived from the fruit of Gardenia jasminoides Ellis, was reported to have activity against various cancer types. In this study, I determined the underlying mechanism for genipin-induced apoptotic cell death in human oral squamous cell carcinoma (OSCC).

Methods: The growth inhibitory effects of genipin in human OSCC cells was examined by the Cell Counting Kit-8, soft agar, and cell line-derived xenograft assays. The effects of genipin on apoptotic cell death were assessed by nuclear morphological changes by DAPI staining, measurement of the sub-G1 population, and annexin V-FITC/PI double staining. The underlying mechanism of genipin activity was analyzed by western blotting, subcellular fractionation of the nucleus and cytoplasm, immunocytochemistry, and quantitative real-time PCR.

Results: Genipin inhibited the growth of human OSCC cells both in vitro and in vivo. Genipin also induced apoptotic cell death in human OSCC cells, which was mediated through a caspase-dependent pathway. Genipin reduced phosphorylation of signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3) at Tyr705 as well as its nuclear localization. Furthermore, the inhibition of p-STAT3Tyr705 levels following genipin treatment was required for the reduction of survivin and myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) expression, which resulted in apoptotic cell death. The genipin-mediated reduction in survivin and Mcl-1 expression was caused by transcriptional and/or post-translational regulatory mechanisms, which occurred in a cell context-dependent manner.

Conclusions: The results provide insight into the regulatory mechanism by which genipin induces apoptotic cell death through the abrogation of STAT3 phosphorylation within the nucleus and suggest that genipin represents a potential therapeutic option for the treatment of human OSCC.

1. 목 적: 이전 연구에 따르면 제니핀 (genipin)은 구강 편평상피세포암종 (OSCC)을 포함하는 여러 유형의 암에 대해 세포 독성이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 구강 편평상피세포암종 세포주에서 제니핀의 항암 효능을 설명하는 메커니즘은 현재까지 미미한 실정이다. 본 연구는 구강 편평상피세포암종 세포주에서 제니핀이 유도하는 항암 효능의 근본적인 메커니즘을 규명하는 것을 목표로 한다.

2. 재료 및 방 법: 구강 편평상피세포암종에서 제니핀의 세포증식 억제 효과는 Cell Counting Kit-8, soft agar 및 세포주 유래 이종 이식 동물모델을 통해 평가되었다. 또한, 세포사멸 (apoptotic cell death)을 유도하는 제니핀의 효능은 DAPI staining을 통한 핵의 형태학적 변화, sub-G1 분석, Annexin V/PI double staining 과 cleaved PARP 및 cleaved caspase 3 단백질의 검출을 통해 평가되었다. 제니핀에 의해 매개되는 signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3)의 활성억제 메커니즘은 western blotting, subcellular fractionation of the nucleus and cytoplasm, immunocytochemistry 와 quantitative real-time PCR을 통해 STAT3의 타겟 유전자들의 발현을 확인하였다.

3. 결 과 및 고찰: 제니핀은 in virto 및 in vivo에서 구강 편평상피세포암종에서 세포증식 억제했다. 또한 제니핀은 cleaved PARP 과 cleaved caspase 3단백질 발현을 농도의존적으로 증가시켰으며, pan-caspase 억제제인 Z-VAD-FMK를 처리함으로써, 제니핀에 의한 세포 사멸이 caspase 3에 의존적인 경로를 통하여 유도되는 것을 확인하였다. Subcellular fractionation 과 immunocytochemistry를 통해 제니핀이 핵에 존재하는 p-STAT3(Y705)의 발현을 농도의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 제니핀에 의한 p-STAT3(Y705) 발현의 억제는 세포 사멸에 연관된 단백질인 survivin 과 myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) 발현의 감소를 초래했다. 제니핀에 의해 매개되는 survivin 및 Mcl-1 발현의 감소는 전사 및/또는 번역 후 조절 메커니즘에 의해 발생했으며, 이는 세포 맥락에 의존적인 방식으로 발생했다. 이 연구로, 제니핀이 구강 편평상피세포암종에서 STAT3의 활성을 억제하고 타겟 유전자들의 발현을 감소시킴으로써 세포사멸을 유도할 수 있는 항암 효능을 제시하였다.