Investigation of Integral Stereoselectivity Based on Kinetic Modeling for Lipase-catalyzed Triacylglycerol Hydrolysis

Abstract

라이페이스는 독특한 촉매 활성을 가진 효소로 식품가공 등 다양한 산업분야에 응용되고 있으며, 트리아실글리세롤(TAG)에서 거울상 이성질체 관계의 위치(sn-1 및 sn-3)를 구별하는 능력을 나타내는 라이페이스의 입체선택성은 산업 분야의 적용에 중요한 특성으로 주목받고 있다. 입체선택성은 다이아실글리세롤(DAG)의 거울상 초과량의 측정을 통해 결정되어 왔으나, 이는 연속적인 반응 단계로 이루어진 TAG 가수분해의 특징과 비효소적 아실 전이반응을 고려하지 않아 진정한 입체선택성을 나타내기에는 불충분하였다. 이에 본 연구에서는 '통합적 입체선택성' 개념을 제안하고, 새롭게 정립된 분석기법을 이용하여 이를 조사하였다. 이 접근법을 통해 TAG 가수분해의 각 단계에서 생성된 모든 아실글리세롤에 대한 라이페이스의 입체선택성을 성공적으로 분석하고 결정했다. 먼저, 트리올레오일글리세롤(TOG)과 그 가수분해물인 올레산, 모노올레오일글리세롤(MOG) 이성질체 3종 및 디올레오일글리세롤(DOG) 이성질체 3종의 직접적·동시적 분리를 위해 HPLC-ELSD 방법을 구축하였다. 아밀로오스 트리스-(3,5-디메틸페닐카바메이트) 유도체로 구성된 단일한 키랄 고정상(CSP) 컬럼을 사용하여 MOG(1-sn-MOG 및 3-sn-MOG) 및 DOG(1,2- sn-DOG 및 2,3-sn-DOG) 거울상 이성질체를 포함한 모든 물질을 20분의 분석시간에 1.5 이상의 분해능으로 분리하였으며, 이는 이전에 확립된 직렬 컬럼을 이용한 방법보다 진보한 것이었다. 돼지 췌장(PPL), Chromobacterium viscosum(CVL), Pseudomonas fluorescens 유래 라이페이스(PFL) 및 Candida antarctica 유래 라이페이스 A(CALA)를 이용한 역미셀계에서의 TOG 가수분해 반응 곡선을 분석하여 확립된 방법을 검증했다. 결과적으로 4가지 모델 라이페이스 모두 이전에 보고된 것과 동일한 DOG 생성 패턴을 보여 라이페이스 촉매 TOG 가수분해 분석을 위해 새로 확립된 방법의 효율성, 정확성 및 적합성을 입증했다. 다음으로, 통합적 입체선택성을 정량적으로 입증하기 위해 동역학 모델을 구축하고 검증했다. 동역학 모델은 라이페이스 촉매 작용의 Ping-Pong Bi-Bi 메커니즘, 지방산에 의한 경쟁적 억제 및 비효소적 아실 전이를 기반으로 구성되었다. 비선형 회귀를 이용하여 초기 기질 농도의 변화에 따른 TOG 가수분해 반응곡선을 맞추는 데 사용되었다. TAG, DAG 및 모노아실글리세롤(MAG) 이성질체의 모든 위치에서 가수분해 속도를 나타내는 12개의 동역학 파라미터 (K1-K12)를 4개의 모델 라이페이스를 대상으로 결정하였다. 그 결과, PPL, CVL 및 PFL에 의한 TOG 가수분해의 주요 반응 경로는 TOG에서 1,2-sn-DOG 또는 2,3-sn-DOG을 거쳐 2-sn-MOG로 이어지지만, CALA에 대해서는 TOG에서 1,3-sn-DOG를 거쳐 1-sn-MOG로 이어지는 것으로 나타나는 차이를 보였다. 셋째로, 라이페이스가 촉매하는 TAG 가수분해에서 통합적 입체선택성에 대한 지방산 사슬 종류의 영향을 조사했다. 이를 위해 다양한 길이와 포화도를 갖는 지방산 사슬(C14:0, C16:0, C18:0 또는 C18:2)로 구성된 TAG, DAG 및 MAG의 모든 이성질체의 동시 분리 및 정량을 위한 HPLC-ELSD 방법을 확립했다. C16:0 지방산의 아실글리세롤은 TOG 분석에 사용된 동일한 단일 CSP 컬럼에 수정된 이동상 조건을 사용하여 분리되었다. C14:0, C18:0 및 C18:2 지방산의 아실글리세롤은 셀룰로오스 트리스-(3-클로로-4-메틸페닐카바메이트)로 구성된 CSP 컬럼을 사용하여 분리되었다. 모든 DAG 및 MAG 거울상 이성질체에 대한 분해능 계수는 1,2-sn-DAG 및 1,3-sn-DAG(C18:0 지방산)의 경우 약 1.31을 유지한 것을 제외하고 35분의 분석 시간에 1.60 이상으로 나타났다. 이것은 다양한 지방산 사슬의 아실글리세롤을 동시에 직접 분리하는 방법을 입증한 첫 번째 연구이다. 마지막으로, 앞서 언급한 지방산으로로 구성된 TAG, DAG 및 MAG에 대한 4가지 모델 라이페이스의 통합적 입체선택성을 결정하기 위해 라이페이스에 의한 TAG 가수분해의 동역학 모델링을 수행했다. 동역학 파라미터는 TAG의 지방산 유형 변화에 따라 PPL과 CVL이 선택성에서 유의미한 차이를 나타내지 않았으며, 주요 반응 경로가 유지되었다. TOG의 sn-2 위치를 절단할 수 있는 것으로 나타난 PFL은 C16:0 지방산으로 구성된 TAG에 대해 예외적으로 낮은 sn-2 선택성을 보였다. 가장 큰 차이를 보인 CALA는 지방산의 포화 여부에 따라 대조적인 선택성을 보였다. 불포화 지방산의 경우 TAG의 sn-2 위치 및 DAG중 1,3-sn-DAG에 대한 선택성이 가장 높은 반면, 포화 지방산의 경우 TAG의 sn-3 위치 및 DAG 중 1,2(2,3)-sn-DAG에 대한 선택성이 가장 높은 것으로 관찰되었다. 이러한 입체선택성의 반전은 DAG 및 MAG 이성질체 생산에 영향을 미치는 통합적 입체선택성의 기질에 따른 평가가 필요함을 시사한다. 결론적으로 TAG와 그 가수분해물의 동시 분해능을 기반으로 한 효소적 역학 모델링에 의해 결정된 통합적 입체선택성은 라이페이스의 입체화학적 특성을 설명하는 유용한 지표로서, 궁극적으로 입체특이적 재구성지질의 생산을 위한 라이페이스의 선택, 스크리닝 및 개발 과정에 기여할 수 있을 것이다.

Lipase is an enzyme that holds a great significance in various fields of industry including dairy, pharmaceutical, and food processing, mainly for fat and oil modification. Stereoselectivity, which refers to the ability to differentiate between enantiomeric positions (sn-1 and sn-3) in triacylglycerol (TAG), is a distinctive characteristic of lipase which plays a major impact on its application for the synthesis of structured lipids including enantiomeric diacylglycerol (DAG) and monoacylglycerol (MAG). The stereoselectivity has been determined by enantiomeric excess of diacylglycerol (DAG). However, this is insufficient to represent the true stereoselective nature of lipase because various isomers of DAG and MAG involved in the consecutive steps of TAG hydrolysis, along with non-enzymatic acyl migration, can all affect the overall outcome of the reaction. To overcome this limitation, this study suggested the concept integral stereoselectivity, which represents the selectivity of lipase toward all the acylglycerols produced in different steps of TAG hydrolysis. For this purpose, the present study established analytical methods for determination of integral stereoselectivity and investigated the integral stereoselectivity of model lipases. First, an HPLC-ELSD method was established for the direct and simultaneous resolution of trioleoylglycerol (TOG) and its seven hydrolysates (i.e., oleic acid, monooleoylglycerol (MOG) and dioleoylglycerol (DOG) isomers). Using a single chiral stationary phase (CSP) column composed of amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate), the enantiomeric MOGs (1-sn-MOG and 3-sn-MOG) and DOGs (1,2-sn-DOG and 2,3-sn-DOG) were baseline-resolved at resolution factors of over 1.5 in the run-time of 20 minutes. The time course of TOG hydrolysis in reverse micelle by lipases from the following sources was then analyzed to validate the established method; porcine pancreas (PPL), Chromobacterium viscosum (CVL), Pseudomonas fluorescens (PFL), and lipase A from Candida antarctica (CALA). As a result, all model lipases yielded DOG profiles that match those of the previous reports, which strongly demonstrated the improved efficiency, accuracy, and suitability of the established method for the analysis of lipase-catalyzed TOG hydrolysis compared to the previous tandem-column method. Next, a kinetic model of stereoselective lipase-catalyzed TAG hydrolysis was established and validated to quantitatively demonstrate the integral stereoselectivity. The kinetic model was constructed based on Ping-Pong Bi-Bi mechanism of lipase catalysis, competitive inhibition by fatty acid (FA), and non-enzymatic acyl migration. Nonlinear regression was used to fit the time courses of TOG hydrolysis with changes in the initial substrate concentration. The twelve kinetic parameters (K1-K12) representing the conversion rate in all positions of TAG, DAG, and MAG isomers were estimated for the four model lipases. Comparison of the kinetic parameters showed that the main reaction pathways for TOG hydrolysis by PPL, CVL, and PFL were from TOG to 1,2-sn-DOG or 2,3-sn-DOG and then 2-sn-MOG, while that for CALA was from TOG to 1,3-sn-DOG and then 1-sn-MOG. Therefore, the integral stereoselectivity determined with the kinetic model was able to describe the whole process of the lipase-catalyzed TAG hydrolysis. Based on these analytical processes established with TOG as model substrate, the integral stereoselectivity under the influence of varying FA chains was analyzed to investigate the effects of the substrate type on the lipase-catalyzed TAG hydrolysis. An HPLC-ELSD method was established for simultaneous separation and quantification of all isomers of TAG, DAG, and MAG composed of the following FA chains with varying lengths and saturation degrees; C14:0, C16:0, C18:0, or C18:2. The acylglycerols with C16:0 FA were resolved using the same single CSP column used for the analysis of TOG under a slightly modified mobile phase condition. The acylglycerols with C14:0, C18:0, and C18:2 FAs were separated using a CSP column composed of cellulose tris-(3-chloro-4-methylphenylcarbamate). The resolution factors for all enantiomers of DAG and MAG were over 1.60 in the run-time of 35 minutes, except that for 1,2-sn-DAG and 1,3-sn-DAG with C18:0 FA 1.31. To the best of my knowledge, this is the first study to demonstrate a methodology for simultaneous and direct resolution of acylglycerols and FAs of varying acyl chains. Finally, kinetic modeling of lipase-catalyzed TAG hydrolysis was carried out to determine the integral stereoselectivity of the four model lipases on TAG, DAGs, and MAGs composed of the aforementioned FAs. The kinetic parameters demonstrated that PPL and CVL do not display significant differences in selectivity when FA types are varied in TAG, indicating that their main reaction pathways remain unaltered. PFL, which was capable of cleaving the sn-2 position of TOG, showed exceptionally low sn-2 selectivity for TAG with C16:0 FA. In addition, CALA displayed contrasting selectivity depending on the saturation degree of FA. The highest selectivity on the sn-2 position for TAG and 1,3-sn-DAG among DAGs was observed for unsaturated FAs, while the sn-3 position for TAG and 1,2(2,3)-sn-DAG among DAGs were the most dominant for saturated FAs. Such dramatic differences in stereoselectivity suggested that the integral stereoselectivity affecting the production of DAG and MAG should be evaluated in a substrate-dependent manner. In conclusion, integral stereoselectivity determined by the enzymatic kinetic model based on the simultaneous resolution of TAG and its hydrolysates is a novel and accurate index for lipase stereochemistry. The concept of integral stereoselectivity and its analytical method ultimately contribute to the processes of selection, screening, and development of stereo-specific lipids for various industrial applications.