Time-resolved profiling of mRNA-protein interaction through the mRNA life cycle

Abstract

mRNAs continually change their protein partners throughout their life cycle, yet our understanding of mRNA-protein complexes (mRNPs) is limited by a lack of temporal information. Here, we present time-resolved mRNA interactome data by combining pulse metabolic labeling with photoactivatable ribonucleoside, UVA crosslinking, poly(A)+ RNA isolation, and mass spectrometry. This approach allows the quantification of over 700 mRNA-binding proteins (mRBPs) across ten distinct time points. The chronological orders of RNA binding were consistent with the known functions, subcellular localizations and protein-protein interactions of the RBPs. Stress granule proteins were found to be enriched in "aged" mRNPs, implying their roles in the terminal stages of the mRNA life cycle. Many late binding RBPs were previously known as viral RBPs, suggesting their regulatory activities on viruses. We also built a computational model to systematically identify RBPs with unexpected binding dynamics based on their Gene Ontology annotations, indicating that they may have some unknown functions. We identify numerous mRBPs with unexpected dynamics, implying undiscovered functions and regulatory mechanisms. For data exploration, we have developed a web application available at chronology.rna.snu.ac.kr. By introducing a time dimension, this study offers a unique resource and insights into mRNP remodeling.

mRNA는 수많은 RNA 결합 단백질들과 결합하며 mRNA의 일생 동안 결합 단백질 조합은 지속적으로 변경된다. 하지만 이렇게 시간적으로 mRNA 결합 단백질의 종류와 조합이 변하는 것을 알고 있는데도 불구하고 지금까지 mRNA-단백질 복합체 (mRNP)에 대한 연구는 어떤 단백질이 mRNA에 결합하는지에 대한 정보를 위주로 이뤄져 왔고 이러한 단백질들이 어떤 순서로 어떻게 결합하는지에 대해서는 많은 연구가 이뤄지지 않았다. 본 연구에서는 4-thiouridine을 이용한 RNA 표지법과 UVA 크로스링킹, RNA 분리 및 질량 분광법을 결합하여 mRNA의 일생동안 시간대별로 mRNA와 상호작용하는 단백질체에 대한 역학 데이터를 얻었다. 구체적으로는 mRNA가 전사되고 5시간이 지나기까지 10개의 시점 동안 700개 이상의 mRNA 결합 단백질의 변화를 정량적으로 관찰할 수 있었다. 이렇게 확인한 mRNA 결합 단백질들의 mRNA 결합 순서는 기존 연구들을 통해 일반적으로 알려진 단백질의 기능, 세포 내 위치 및 상호작용과 대체적으로 일치하였다. 흥미롭게도 stress granule과 바이러스 RNA에 연관된 단백질들이 오래된 시점까지 mRNA와 결합하는 것으로 발견되었으며 이는 이러한 단백질들이 mRNA 생명주기의 마지막 단계에서 아직 구체적으로 밝혀지지 않은 어떤 역할을 할 수도 있다는 것을 시사한다. 이 연구에서는 또한 기존에 연구되어 왔던 RNA 결합단백질들의 기능연구를 바탕으로 다양한 RNA 결합 단백질들의 mRNA의 결합 역학 예측값을 계산하고 이를 실제 관측한 mRNA 결합 역학값과 비교하였다. 이러한 비교를 통해 밝혀낸 예상치 못한 mRNA 결합 역학을 가진 다수의 RNA 결합 단백질들의 존재는 이 단백질들이 아직 알려지지 않은 기능과 조절 메커니즘을 가지고 있을 수도 있다는 것을 시사한다. 이 연구는 기존의 mRNA 결합 단백질체 데이터에 새롭게 시간적 차원을 도입함으로써 mRNP 리모델링에 대한 독특한 자원과 통찰력을 제공한다.