High-Voltage High-Frequency Pulsed Field Ablation for the Treatment of Locally Advanced Solid Tumor

Abstract

Pulsed field ablation (PFA), a focal tissue ablation method, uses short high electric pulses resulting in cell death in target tissue by irreversibly permeabilizing the cell membrane. Unlike other focal ablation modalities such as radiofrequency ablation (RFA), microwave, high intensity focused ultrasound (HIFU), and cryoablation, PFA is a non-thermal ablation sparing extracellular matrix (ECM), vasculature, nerves, and ductal networks, which results in rapid tissue regeneration and preservation of tissue function. Therefore, PFA is presented to be an alternative instead of other thermal focal ablation modalities or adjuvant therapy of chemotherapy for locally advanced solid tumor (LAST) such as locally advanced pancreatic cancer (LAPC), locally advanced prostate cancer (LAPRC), and hepatocellular carcinoma (HCC). Most of the research was focused on clinical and preclinical trials with low-frequency pulsed field ablation (LF-PFA). However, few studies have been approached from a tissue engineering perspective based on decellularization and recellularization to investigate tissue scaffold fabrication and tissue regeneration using high-frequency pulsed field ablation (HF-PFA). In this dissertation, we developed a method to evaluate the electroporated area by PFA in an in-vitro model to prescreen the optimal conditions to successfully ablate LAST without margin live cells. Also, we fabricated HF-PFA derived tissue scaffold in the in-vitro 3D culture model and utilized the perfusion bioreactor system to observe tissue regeneration on the decellularized scaffold. HF-PFA generator and electrodes system were manufactured by The Standard Co., Ltd (Gunpo-si, Korea). Cell apoptosis of human prostate cancer tissue was studied using HF-PFA. Finally, the decellularization and tissue regeneration process after HF-PFA were reconfirmed in the in-vivo experiment using prostate tissue of canine. The hypothesis underlying my research is that HF-PFA can (i) fabricate decellularized tissue scaffold to ablate LAST with cell apoptosis, and (ii) provide the environments for rapid and proper tissue regeneration. The main results of my dissertation research can be summarized as follows. First, a novel evaluation method was developed to evaluate electroporated areas caused by HF-PFA on the potato model. It takes about 12 hours to evaluate the HF-PFA ablated areas using a common method of polyphenol oxidation. Using our 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) method, the electroporated areas can be assessed within 3 hours and reversibly electroporated areas also can be observed, which makes it possible to predict the HF-PFA affected zone in the drug delivery or gene transfection research field. The various HF-PFA conditions such as voltage, pulse number, pulse width, pulse interval for in-vitro, in-vivo studies were indirectly performed and prescreened using the TTC method on the potato model. Second, an in-vitro 3D culture model of cancer cells was constructed using agarose gel to investigate the tissue scaffold and regeneration ability of HF-PFA based on a tissue engineering perspective. Decellularization was induced by HF-PFA on the gel and regeneration was induced by perfusion bioreactor with adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC). Decellularization was evaluated using a live and dead cell assay kit with a fluorescence microscope and hematoxylin and eosin (H&E). Nerve regeneration was evaluated using immunocytochemistry (ICC) of Tuj1. Third, cell apoptosis of human prostate cancer tissue was studied using HF-PFA. Human prostate cancer tissues were induced on the skin of the nude mouse and HF-PFA was performed on the cancer tissue with monopolar electrodes. The cell apoptosis markers, cleaved caspase-3, and BCL-2 were upregulated after HF-PFA with the weight of cancer tissue decreasing over time. HF-PFA had an effect to induce cell apoptosis and reduce the mass of cancer tissue. Finally, the decellularization and tissue regeneration process after HF-PFA were investigated in the in-vivo experiment using prostate tissue of canine. Cell apoptosis and decellularization process was maximized 4 hours after HF-PFA and the recellularization was observed 7 days after HF-PFA. The prostate tissue was almost regenerated with minor fibrosis at 4 weeks. In the results, HF-PFA successfully fabricated decellularized tissue scaffold to ablate LAST with cell apoptosis and provided the environments for rapid and proper tissue regeneration. Therefore, HF-PFA can be utilized in the field of tissue engineering and regenerative medicine and promotes the rapid and accurate ablation of LAST in clinical surgery to enhance the quality of life.

펄스 전기장 절제(PFA)는 국소 진행성 고형암을 치료하기 위한 국소 조직 절제 방법으로, 마이크로초의 짧은 고전압 전기 펄스를 사용하여 세포막을 비가역적으로 천공하여 세포의 비가역적인 사멸을 초래한다. 고주파 절제(RFA), 마이크로파, 고강도 집적 초음파(HIFU) 및 초저온 절제와 같은 열을 초래하는 절제법과 달리 PFA는 열 발생이 최소화된 비열적 절제법으로 오직 세포만을 사멸하고, 세포외기질(ECM), 혈관, 신경 및 도관과 같은 비세포성 조직은 보존하여 빠른 조직 재생 및 조직 기능의 보존을 가능하게 한다. 따라서 PFA는 국소 진행성 췌장암(LAPC), 국소 진행성 전립선암(LAPRC) 및 간세포 암종(HCC)과 같은 국소 진행성 고형 종양(LAST)에 대한 다른 열적 국소 절제 방식의 대안으로 또는 항암 화학 요법의 보조 요법으로 제시된다. 대부분의 연구는 저주파 펄스 필드 절제(LF-PFA)를 사용한 임상 및 전임상 시험에 집중되었다. 그러나, 고주파 펄스 필드 절제(HF-PFA)를 사용하여 조직의 탈세포 및 조직 재생을 조사하기 위해 조직 공학 관점에서 접근한 연구는 전무하다. 본 논문에서는 감자 모델에서 HF-PFA에 의해 전기천공된 영역을 평가하여 LAST를 성공적으로 제거하기 위한 최적의 조건을 사전 선별하는 방법을 개발하였다. 또한, 체외 3D 배양 모델에서 HF-PFA를 이용한 탈세포화된 조직 지지체를 제작하고 탈세포화된 지지체에서 인간 지방유래줄기세포 (hADMSC)의 신경 조직 분화능을 조사하였다. HF-PFA 시스템 및 전극은 (주)더스탠다드(군포시, 한국)에서 제조하였다. HF-PFA를 사용하여 인간 전립선암 조직의 세포 사멸을 연구하였다. 마지막으로 개의 전립선 조직을 이용한 생체 내 실험에서 HF-PFA 후 탈세포화 및 조직 재생 과정을 재확인하였다. 연구의 기초가 되는 가설은 HF-PFA가 (i) 세포 사멸로 LAST를 제거하기 위해 탈세포화된 조직 스캐폴드를 유도할 수 있고, (ii) 신속하고 적절한 조직 재생을 위한 환경을 제공할 수 있다는 것이다. 논문 연구의 주요 결과는 다음과 같이 요약될 수 있다. 첫째, 감자 모델에서 PFA로 인한 전기천공 영역을 평가하기 위한 새로운 평가 방법이 개발되었다. 기존 연구들에서 널리 차용된 폴리페놀 산화를 통한 멜라닌 색소 침착법을 이용하여 PFA를 통한 탈세포 영역을 평가하는 데 약 12시간이 걸린다. 반면, 본 연구에서 새롭게 제시한 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) 방법을 사용하면 탈세포 영역을 3시간 이내에 평가할 수 있으며 가역적으로 전기천공 된 영역도 추가적으로 관찰할 수 있어 약물 전달 또는 유전자 형질감염 등 분야에서 요구되는 PFA로 인한 가역적 전기천공 영역을 예측할 수 있다. 생체 외, 생체 내 연구를 위한 HF-PFA의 전압, 펄스 수, 펄스 폭, 펄스 간격 조건을 감자 모델에서 TTC 방법을 사용하여 간접적으로 수행하고 사전 선별했다. 둘째, 암세포의 체외 3D 배양 모델을 아가로스 겔, 메트리겔을 사용하여 제작하고 조직 공학적 관점을 기반으로 HF-PFA의 탈세포 지지체 유도 및 조직 재생 능력을 조사하였다. HF-PFA에 의해 3D 하이드로겔의 탈세포화가 유도되었고 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)가 탈세포화 된 지지체에 로딩되어 관류식 생물반응기로 분화배양배지를 순환하며 배양되었다. 탈세포화는 형광 현미경을 통해 live & dead cell kit 를 사용하여 평가되었다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, Tuj1과 같은 신경 조직 재생 마커의 면역세포화학염색(ICC)을 사용하여 재세포화를 평가하였다. 셋째, HF-PFA를 사용하여 인간 전립선암 조직의 세포 사멸을 연구하였다. 인간의 전립선암 조직은 누드 마우스의 피부에 유도되었고 HF-PFA는 단극성 전극으로 암 조직에 수행되었다. 세포 사멸 마커인 절단된 caspase-3 및 BCL-2는 HF-PFA 후에 상향 조절되었고 암 조직의 무게는 시간이 지남에 따라 감소했다. HF-PFA는 세포 사멸을 유도하고 암 조직의 질량을 줄이는 효과가 있었다. 마지막으로, 개의 전립선 조직을 이용한 생체 내 실험에서 HF-PFA 이후의 탈세포화 및 조직 재생 과정을 조사하였다. 세포 사멸 및 탈세포화 과정은 HF-PFA 4시간 후에 극대화되었고 재세포화는 HF-PFA 7일 후에 관찰되었다. 전립선 조직은 4주에 약간의 섬유증과 함께 거의 재생되었다. 결론적으로, HF-PFA는 세포 사멸로 LAST를 제거하기 위해 탈세포화된 조직 지지체를 성공적으로 유도하고 신속하고 적절한 조직 재생을 위한 환경을 제공했다. 따라서 HF-PFA는 조직공학 및 재생의학 분야에서 활용될 수 있으며 임상 수술에서 LAST의 신속하고 정확한 절제를 촉진하여 삶의 질을 향상시킬 수 있을 것으로 보인다.