Regulatory roles of OsGATA16 in chloroplast development in rice

Abstract

엽록체는 엽록소 축적을 통한 광합성을 하는 중요한 기관으로, 벼에서의 엽록체 연구는 광합성 효율 개선을 통한 수량성 증가나 hybrid-rice 육종시에 편리한 마커로서 사용될 수 있기에 중요하다. 특히 C3인 벼를 C4로 바꾸었을 때, 두 배가량의 수확량 증가가 예상되기에 이를 위해 오랫동안 많은 연구들이 있어왔다. 본 연구에서는 애기장대에서 많은 연구가 이루어진, 엽록체 발달에 있어 Master regulator 역할을 할 것이라고 예상되는 GNC (AtGATA21) 유전자를 토대로 벼에서도 상동유전자인 OsGATA16 유전자의 엽록체 발달 관련 기능에 대해 분석하였다. 엽록체 발달에 중요한 역할을 한다고 알려진 호르몬인 cytokinin을 처리했을 때와 식물체를 암조건에서 기른 후 빛조건으로 바꾸었을 때 OsGATA16의 발현이 늘어남을 확인하였고 잎발달에 따른 OsGATA16의 발현패턴을 분석하였을 때 상위의 갓나온 잎에서 오래된 잎보다 발현량이 높음을 확인하였다. Yeast one hybrid assay를 통해 OsGATA16의 DNA결합서열이 GATA 가 아니라 GATC 서열에 결합함을 밝혀내었다. 애기장대 GNC 유전자와 마찬가지로, T-DNA가 삽입된 osgata16 knockout 돌연변이체의 경우, 야생형에 비해 전체적으로 연녹색 표현형을 보이고 OsGATA16 과발현체는 야생형에 비해 매우 진한 녹색을 가짐을 확인하였다. 그뿐만 아니라, 과발현체의 경우 원래 엽록체가 잘 발달되지 않는 잎의 주맥, 뿌리 그리고 캘러스에서 엽록체가 발달되고 투과전자현미경을 통해 유관속초 세포에서도 야생형에 비해 엽록체가 더 크고 발달됨을 확인하였다. 유관속초 세포에서의 엽록체발달은 C3인 벼를 C4로 만들기 위한 첫번째 과정으로, OsGATA16이 C4 벼를 만들기위한 연구에 쓰일 수 있음을 보여준다. 전사인자인 OsGATA16이 어떤 하위 유전자들의 발현을 조절하는지 확인하기위해 상위 첫번째 잎에서 RNA를 추출해 cDNA를 합성한 후 qRT-PCR을 통해 엽록체 및 엽록소 관련 유전자들의 발현량을 확인하였다. 전반적으로 osgata16 돌연변이체에서 발현이 낮음을 확인하였고, 과발현체를 사용하는 대신 야생형 잎에서 추출한 원형질체에 OsGATA16의 일시적 과발현(transient overexpresssion)에서는 발현이 올라감을 확인하였다. 특히 이러한 유전자들 중 프로모터 서열에 OsGATA16 단백질의 DNA 결합 모티프가 연속되게 많이 있는 유전자인 OsPORA와 OsPORB에 대해 luciferase assay와 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay를 통해 OsGATA16 단백질이 두 유전자 프로모터에 결합하여 upregulation 함을 확인하였다. 이를 통해 애기장대와 마찬가지로 벼에서도 OsGATA16이 엽록체 및 엽록소 발달에 중요한 역할을 함을 밝혀내었다.

Chloroplast is an important organ that performs photosynthesis, which is important for the growth and development of plants. Since photosynthetic efficiency greatly affects plant productivity, understanding the underlying regulatory mechanisms in rice plants can be useful for strategies to increase grain and biomass yields. In Arabidopsis thaliana, GNC (GATA, NITRATE INDUCIBLE, CARBON-METABOLISM INVOLVED) and GNL/CGA1 (GNC-LIKE/CYTOKININ-RESPON SIVE GATA FACTOR1) have been well documented for the direct, positive regulator of chlorophyll and chloroplast biogenesis and are candidates for master controllers for chloroplast development. However, in rice, the regulatory roles of OsGATA16, orthologous gene of Arabidopsis GNC, are largely unknown. Here, we show that the T-DNA insertion knockdown osgata16 mutant show a pale-green phenotype and OsGATA16 overexpression lines have dark-green phenotype and accumulate chlorophyll also in tissues such as mid vein, root, callus and lamina joint, where chlorophyll does not visibly accumulate in the wild type. To identify the molecular mechanism, we performed RT-qPCR analysis, revealing that most of chlorophyll biosynthesis and photosynthesis genes are down-regulated in osgata16 mutant and up-regulated when OsGATA16 was transiently expressed in protoplasts. Using luciferase assays and Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays, we found that OsGATA16 bound to the promoters of two chlorophyll biosynthetic genes, OsPORA and OsPORB, and promotes their transcription. In addition, we also found by transmission electron microscopy analysis that overexpression of OsGATA16 enhanced chloroplast development in vascular bundle sheath cells and it was a first step toward engineering C4 rice. Taken together, our results demonstrate that like Arabidopsis GNC, OsGATA16 functions to promote chlorophyll synthesis and chloroplast development.