Structural analysis of carbon monoxide dehydrogenase (CODH) with enhanced oxygen resistance

Abstract

Carbon monoxide dehydrogenase (ChCODH-II) from Carboxydothermus hydrogeno formans is an anaerobic bacteria catalyzing the oxidation of CO to CO2. While this enzyme has the highest conversion rate compared to other CODHs, it is sensitive to oxygen, limiting practical applications. To overcome this limitation, the previous study focused on introducing mutations involving histidine, tryptophan, and serine residues with bulky aromatic rings at the internal bottleneck site of the gas tunnel connected to the C-cluster, as residue A559. However, these variants maintained activity only under low oxygen concentrations (0.1-0.5% O2). Therefore, in this study, ChCODH-II variants were developed that retain CO version activity even under atmospheric oxygen conditions (20% O2). Additional mutations were introduced at V610 to histidine or tryptophan, which are in close proximity to the non-selective tunnel while being connected to the C-cluster. Through X-ray crystallography of the variants under anaerobic conditions, I demonstrated the reason for the enhanced oxygen resistance. Furthermore, tunnel analysis revealed that introduced mutations resulted in the narrowing of the tunnel entrances around the mutated residues when compared to the ChCODH-II WT. To investigate the structural integrity of the mutants under oxygen exposure, anaerobically purified proteins were exposed to 2 hours of oxygen, and then crystallization was conducted under anaerobic conditions. Omit maps (Fo-Fc) and Fe anomalous maps showed that C and D clusters of ChCODH-II WT were damaged, while the WH (A559W/V610H) variant retained its structural integrity. Tunnel analysis further confirmed that the tunnels had narrowed, consistent with the results obtained from crystallization under anaerobic conditions. It was shown that introducing mutations involving histidine and tryptophan, which have large aromatic rings, into A559 and V610 results in the constriction of non-selective gas tunnels, dramatically blocking O2 gas and enhancing O2 resistance. Keywords : Carbon monoxide dehydrogenase, ChCODH-II, protein structure, O2 tolerance, CO reduction Student number : 2021-27351

Carboxydothermus hydrogenoformans로부터 분리된 ChCODH-II는 일산화탄소를 이산화탄소로 산화시킬 수 있는 혐기성효소이다. 이 효소 는 다른 CODH들과 비교하여 일산화탄소의 산화 속도가 빠른 편이지만 산소에 민감하여 실제적인 응용에 어려움이 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 선행연구에서 C-cluster와 연결된 가스 터널의 내부 병목 위치인 A559 잔기에 큰 방향족 링을 가지는 히스티딘, 트립토판 및 세린으로 돌연변이를 도입하는 연구를 진행하였다. 그러나 이러한 돌연변이 형태는 낮은 산소 농도(0.1-0.5% 산소)에서만 활성을 유지할 수 있다는 한계점이 있다. 따라서 본 연구에서는 대기와 같은 산소 조건(20% 산소)에서도 활성을 유지할 수 있는 ChCODH-II를 개발하기 위해 Ccluster와 연결되면서 비선택적 터널의 표면 근처에 위치한 V610에 추가적으로 히스티딘과 트립토판으로 돌연변이를 도입하여 산소 저항성을 향상시키는 연구를 수행하였다. 이를 위해 혐기성 조건에서 결정화된 구조를 분석하여 돌연변이의 산소 저항성 증가 원인을 밝혔다. 또한, 터널 분석을 통해 ChCODH-II WT과 대비하여 돌연변이를 도입한 잔기들의 주변 터널 입구가 좁아지는 것을 확인하였다. 더 나아가, 산소를 노출시켰을 때 돌연변이도입체가 ChCODH-II WT과 대비하여 구조적으로 잘 유지되고 있는지 확인하기위해 2시간 동안 산소에 노출시켜 결정화를 진행하였다. 결과적으로 omit (Fo-Fc)과 Fe anomalous map 을 통해 ChCODH-II WT의 D 와 C 클러스터는 무너졌지만 WH(A559W/V610)는 혐기성 WH와 동일하게 유지되고 있음을 확인하였으며, 터널 분석에서도 WH의 터널이 좁아진 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 A559와 V610잔기에 큰 방향족 링을 가지는 히스티딘과 트립토판으로 돌연변이를 도입하면 비선택적 가스 터널이 좁아져서 산소가 통과하지 못하게 되어 산소저항성이 크게 증가함을 밝혔다