Studies on the Alternative Lengthening of Telomeres with a Unique Template in Mouse Embryonic Stem Cells

Abstract

진핵 생물이 유전체의 정보를 안정적으로 유지하기 위해서는 선형 염색체에만 존재하는 특이적인 문제를 해결해야만 한다. DNA 복제 기구의 생화학적 한계에 기인하는 말단-복제의 문제와 유전체 내부의 DNA 손상과 말단을 구분해야 하는 말단-보호의 문제이다. 두 가지 문제를 제대로 해결하지 못하면, 유전체의 정보는 점차 소실되거나 잘못된 처리에 의해 손상될 수 있다. 두 가지 말단의 문제를 해결하기 위한 특별한 구조체가 텔로미어이다. 텔로미어는 주로 특정한 반복서열과 그에 대한 결합 단백질로 구성되어 있다. 텔로미어의 길이와 구조를 잘 유지하는 것은 세포의 삶과 죽음을 결정하는데 매우 중요하다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어는 내부의 유전 정보를 대신하여 소실되고 특정한 한계 길이에 가까워지면 세포의 분열을 정지시키거나 세포를 죽게 하는 타이머의 역할을 한다. 이 한계를 넘어서 세포가 계속 분열하게 되면, 유전체의 불안정성이 과도하게 증가하여 정상적인 조절이 이루어지지 않는 암세포로 발전할 가능성이 높아진다. 다르게 말하면, 암세포가 텔로미어에 의해 부과된 한계를 넘기 위해서는 반드시 텔로미어의 길이를 유지하는 기능을 획득하는 것이 필요한 것이다. 대부분의 암세포는 텔로머레이즈라고 하는 역전사 효소를 활성화시킴으로써 텔로미어의 길이를 유지하고 무한정 증식할 수 있는 능력을 얻는다. 그러나 일부의 암세포에서 텔로머레이즈 없이도 텔로미어 길이를 유지하는 현상이 관찰되었는데, 이를 대안적인 텔로미어 길이 유지 기전 (Alternative lengthening of telomere, ALT) 이라고 한다. 암세포뿐만 아니라 효모나 선충 등의 모델에서 텔로머레이즈 없이도 텔로미어를 유지하는 현상이 관찰되면서, ALT는 자연 상에 널리 존재할 수 있다는 것이 알려졌다. ALT는 상동 재조합에 의존하는 DNA 복제 기전이라는 것이 알려졌지만, 구체적인 기전의 작동 방식에 관해서는 연구되지 않은 바가 많다. 본 연구에서는 쥐 배아줄기세포 (mouse embryonic stem cell, mESC) 모델을 이용해서 ALT의 특징과 분자적 기전을 규명하고자 했다. 전유전체 서열분석을 통해 ALT mESC의 텔로미어가 가지는 독특한 서열과 구조를 밝혔다. 가장 중요한 특징은 서브텔로미어에 존재하는 특이한 주형 서열이 텔로미어를 구성하고 있다는 점이다. 일반적인 텔로미어 반복 서열이 아니라 다른 서열이 많이 끼어든 만큼, ALT mESC의 텔로미어는 독특한 보호 기전을 유지하고 있을 것이라고 추측 가능하다. 이를 확인하기 위해 전사체 분석과 정량적 단백질체 분석을 수행했으며, 그 결과 ALT의 활성화에 뒤따르는 유전자 발현 변화 양상을 관찰할 수 있었다. 대표적으로 전사 조절 네트워크와 염색질 재구성 과정에 변화가 집중되어 있었다. ALT의 기전과 관련되어 있을 것으로 추정되는 후보 유전자 중에서 ALT 특이적으로 가장 많이 증가한, 비일반적인 히스톤인 HMGN1의 기능에 초점을 맞추었다. HMGN1은 뉴클레오좀을 구성하는 연결 히스톤인 H1 히스톤과 경쟁하고 다른 히스톤들의 번역 후 변형에 관여하여 염색질의 구조를 느슨하게 만들 수 있다고 알려져 있다. HMGN1이 ALT mESC의 독특한 텔로미어에 결합한다는 것을 확인했고, HMGN1의 기능을 저해할 경우 텔로미어의 손상 정도가 증가하고 텔로미어에서 생산되는 전사체의 양이 감소했으며 텔로미어 길이가 짧아졌다. 따라서 HMGN1이 만들어내는 변화가 ALT 텔로미어를 안정적으로 유지하는데 필요한 요소임을 확인했다. 본 연구에서는 ALT가 활성화되기 전후의 쥐 배아줄기세포를 이용하여 ALT 특이적인 분자적 특징을 유전체, 전사체, 단백질체의 관점에서 고찰했다. 그 핵심에는 독특한 주형 서열이 만들어내는 특이한 구조의 텔로미어와 후성유전학적 조절자로 작용하는 HMGN1 단백질이 있다. 특이한 주형 서열을 텔로미어 유지에 사용하는 현상은 효모부터 포유류까지 진화적으로 보존된 현상이다. 쥐 배아줄기세포에서 확립된 ALT 모델이 ALT의 분자적 기전뿐만 아니라 유전체의 잠재적인 진화 기전을 이해하는데 기여할 것으로 기대한다.

In order for eukaryotes to maintain genomic information, they must solve specific problems caused by their linear chromosomes: the end-replication problem due to the biochemical limitations of DNA replication machinery and the end-protection problem that must distinguish between DNA damage and the very end of the genome. If the two problems are not properly solved, the information of the terminal region is endangered to gradually disappear or to be damaged by incorrect processing. The special structure to solve these problems of the end is telomere. Telomere consists mainly of specific repeat sequences and their binding proteins. It is crucial in determining cell life and death to maintain telomere length and structure. Each time a cell divides, telomere is lost due to the end replication problem. When telomere length reaches a certain limit, it acts as a molecular timer to stop cell division or kill the cell. As a cell continues to divide beyond the limit, the genomic instability increases excessively and the cell is more likely to develop into a cancer cell. In other words, in order for cancer cells to cross the limit imposed by telomere, it is necessary to acquire a functional mechanism to preserve the length of telomere. Most cancer cells reactivate the reverse transcriptase, telomerase, to maintain telomere length and gain the ability to grow indefinitely. However, in some cancer cells, the phenomenon of maintaining telomere length without telomerase was observed, which is called alternative lengthening of telomere (ALT). It has been known that ALT can be widely present in nature, as there are examples of telomerase-independent telomere maintenance mechanism in some plants and animals. Although ALT has been known to be a DNA replication mechanism that relies on homologous recombination, the exact molecular mechanism remains elusive. In this study, I used mouse embryonic stem cell (mESC) model to investigate the features and the molecular mechanisms of ALT. Whole genome sequence analysis revealed the unique sequence and structure of the telomere of ALT mESC. The most important feature was that the unique template sequence present in the subtelomere constituted telomere. It is a reliable hypothesis that telomeres of the ALT mESC maintain a unique protective mechanism, as non-telomeric sequences are highly involved, rather than the normal telomere repeats. To confirm this hypothesis, transcriptome and quantitative proteomic analysis were performed. As a result, I identified the pattern of gene expression changes following activation of ALT. The fundamental pathways enriched in ALT were transcriptional regulatory network and chromatin remodeling. I focused on the function of HMGN1 (high mobility group nucleosome binding domain 1), a non-canonical histone, which was the most significantly increased in ALT mESC among the candidate genes presumed to be involved in the mechanism of ALT. HMGN1 can compete with the linker histone H1 and contribute to post-translational modifications of other histones, thereby loosening the chromatin structure. I confirmed that HMGN1 binds to the unique telomere of ALT mESC. In addition, the inhibition of the function of HMGN1 increased the degree of telomere damages, reduced the amount of transcripts produced in telomere, and shortened the telomere length. Therefore, it was confirmed that the change produced by HMGN1 is a necessary factor to keep ALT telomere stable. In this study, the molecular characteristics of ALT mESCs were examined in terms of genome, transcriptome, and proteome. The main feature is the distinct structure of the telomere produced by a unique template and HMGN1 protein acting as an epigenetic regulator. The phenomenon of using a unique template sequence for telomere preservation is evolutionarily conserved from yeast to mammal. The ALT model established in mESCs will contribute to understanding not only of the molecular mechanism of ALT but of the mechanism of evolution of the genome.