Biomarker Development of Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm and Breast Cancer using Quantitative Proteomics and Bioinformatics

Abstract

서론: 질량분석학 기반 단백체학적 접근법은 미량의 시료에서 수백 개의 차등적으로 발현되는 단백질을 발굴하기 위해 수천 개의 단백질을 동시에 스크리닝할 수 있는 능력을 기반으로, 특정 질병과 연관된 바이오마커를 식별하는 데 점점 더 많이 적용되고 있다. 일반적으로 임상 코호트로부터 수집된 체액과 포르말린 고정 파라핀 포매조직절편 (FFPE)과 같은 병리학적 검체를 분석한다. 단백체 분석에 있어 높은 처리량과 감도를 가진 질량분석학 기반 접근법은 바이오마커 발굴 및 임상 진단 분야에서 강력한 도구로 활용될 수 있다. 또한 단백체 연구는 질병의 생물학적 메커니즘을 이해하는데 도움을 준다.

방법: 1장과 2장에서, 고분해능 질량분석기 기반 단백체학 분석을 수행하여 췌장낭종액 시료에서 췌관내 유두상 점액 종양 (IPMN)의 악성도를 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하였다. 2장에서는 실제 임상 상황을 더 잘 반영하기 위해 췌관내 유두상 점액 종양 뿐만 아니라 점액성 낭성 종양 (MCN)과 장액성 낭성 종양 (SCN)을 추가한 확장된 코호트에서 시료를 수집하였다. 3장에서, 표적 단백체 기술인 다중반응검지법을 FFPE 조직에 적용하여 유방암 환자의 인간 상피 증식 인자 수용체 2 (HER2) 상태를 결정할 수 있는 새로운 분석법을 확립하였다.

결과: 1장에서, IPMN 환자의 췌장낭종액 시료에서 2,992개의 단백질을 동정하였다. IPMN의 조직학적 등급에 따라 차등적으로 발현되는 18개의 바이오마커 후보군이 발견되었으며, 그 중 일부는 독립적인 코호트를 이용하여 웨스턴 블롯으로 검증하였다. 그 결과는 단백체 데이터와 일치하였다. 2장에서, IPMN, MCN, SCN 환자의 췌장낭종액에서 5,834개의 단백을 동정하였다. IPMN 이형성증간에 차별적으로 발현되는 364개의 단백질 중, 19개의 최종 바이오마커 후보군은 IPMN의 악성도에 따라 연속적으로 증가하거나 감소하였다. 독립코호트에서 CD55 단백질을 효소면역측정법 (ELISA), 웨스턴블롯, 면역화학염색 (IHC)을 통해 검증하였으며, 단백체 데이터와 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 3장에서, 우리는 HER2 상태를 구별하기 위한 기존 방법을 개선하는 다중반응검지법을 확립하였다. 충분한 양의 단백질을 확보하는 데 필요한 FFPE 슬라이드 수를 산출하고, 상피 세포 특이적 단백질의 발현량을 HER2 발현량 측정을 위한 정규화 인자로 사용함으로서 시료 전처리를 단순화하였다. 이에 따라 HER2 단백질 정량의 정확성과 정밀도가 향상되었다.

결론: 1장과 2장에서, 우리는 현존하는 최대의 췌장낭종액 단백체 데이터를 생성했으며, IPMN 이형성증의 잠재적 바이오마커를 발굴하였다. 췌장낭종액 바이오마커의 발굴은 IPMN의 악성도를 정확하게 평가하는데 도움이 되며, 외과적 의사 결정을 효과적으로 도울 수 있을 것이다. 궁극적으로, 발굴한 마커가 임상에서 유용하게 사용될 수 있다면, IPMN 이형성증에 대한 정확한 평가를 통해 저위험군 IPMN 환자의 불필요한 수술적 절제를 방지하는데 기여할 수 있을 것이다. 3장에서, 모호한 HER2 그룹을 구별할 수 있는 우리의 프로토콜은 형광동소혼성화 (FISH) 테스트가 필요한 사례의 수를 줄임으로써 유방암 환자의 진단에 필요한 시간과 비용을 잠재적으로 줄일 수 있다. 또한 우리가 개발한 단순화된 분석 절차는 MRM 분석법을 임상에 적용하기 위한 진입 장벽을 낮춰준다. 우리가 확립한 MRM 분석법은 IHC에 비해 보다 정확한 HER2 발현 수준을 산출함으로서, 임상의가 유방암 환자를 위한 적절한 치료 방침을 결정하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

Introduction: Mass spectrometry (MS)-based proteomic approaches are being increasingly applied to identify markers that are related to specific diseases, based on their ability to screen thousands of proteins simultaneously to obtain hundreds of differentially expressed proteins (DEPs) in small amounts of samples. In general, pathologic specimens collected from clinical cohorts, such as body fluids and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues, are analyzed. For proteomic analysis, MS-based approach is a powerful tool in biomarker discovery and clinical diagnosis with its high throughput and high sensitivity. Also, a proteomics study will help understand biological mechanisms of diseases.

Methods: In chapter I and II, high-resolution mass spectrometry-based proteomics was performed using pancreatic cyst fluid samples to discover marker candidates for predicting the degree of intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN) malignancy. In chapter II, samples were collected from the expanded cohort that included IPMNs and other PCLs (mucinous cystic neoplasm (MCN) and serous cystic neoplasm (SCN)) to better reflect actual clinical circumstances. In chapter III, a targeted proteomic technique, multiple reaction monitoring-mass spectrometry (MRM-MS), was applied to formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues to establish a novel assay to determine human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) status in breast cancer patients.

Results: In chapter I, a dataset of 2,992 proteins was constructed from pancreatic cyst fluid samples of IPMN patients. Eighteen biomarker candidates that were differentially expressed across histological grades of IPMN were discovered, and some of them were validated by western blot in an independent cohort, the results of which were consistent with our proteomic data. In chapter II, 5,834 proteins were identified using cyst fluid from patients with IPMN, MCN, and SCN. Among 364 proteins that differentially expressed between IPMN dysplasia, 19 final marker candidates consistently increased or decreased with greater IPMN malignancy. CD55 was validated in an independent cohort by ELISA, Western blot, and IHC, and the results were consistent with the MS data. In chapter III, we established an MRM-MS assay that improves on existing methods for differentiating HER2 status. The accuracy and precision of HER2 quantification were improved by simplifying the sample preparation through predicting the number of FFPE slides required to ensure an adequate amount of protein and using the expression levels of an epithelial cell-specific protein as a normalization factor when measuring HER2 expression levels.

Conclusions: In chapter I and II, we have generated the largest proteomic dataset of pancreatic cyst fluid to date and discovered potential markers of IPMN dysplasia. The development of cyst fluid markers can facilitate an accurate assessment of the degree of IPMN malignancy and effectively guide surgical decision-making. Ultimately, if the developed marker is implemented in clinical practice, the accurate assessment of IPMN dysplasia will prevent unnecessary surgical resection for low-risk IPMN patients. In chapter III, our proposed protocol, which discriminates between equivocal HER2 subgroups, can potentially decrease the time and costs required for the diagnosis of breast cancer patients by reducing the number of cases that require ancillary fluorescence in situ hybridization (FISH) tests. In addition, the simplified assay procedure can reduce the barriers to entry for the clinical application of the MRM-MS assay. Our MRM-MS assay yields more accurate HER2 expression levels relative to immunohistochemistry and should help to guide clinicians toward the proper treatment for breast cancer patients, based on their HER2 expression.