HPLC-FLD, Q-TOF-MS, exoglycosidase array digestion을 이용한 에타너셉트 N-당사슬 분석법 연구

Abstract

에타너셉트 (Etanercept, Enbrel®)는 폴리펩티드 (polypeptide)의 특정 아스파라긴 (Asn, asparagine) 잔기에 N-당사슬 (N-glycan)이 결합되어 있는 당단백질의약품 (therapeutic glycoprotein)이다. 당단백질의약품에 존재하는 N-glycan은 구조적 다양성을 지니며, 의약품의 안정성 (stability), 효능 (efficacy), 항원성 (immunogenecity)과 같은 약리학적 중요 요소에 큰 영향을 미치기 때문에 N-glycan의 불균일성 (heterogeneity)을 입증하기 위한 정성 및 정량적 분석법은 당단백질의약품의 효과적인 품질관리 (QC, quality control) 에 있어 매우 중요하다. 본 연구에서는 당단백질의약품 중 Etanercept에 존재하는 N-glycan의 구조 및 상대정량 분석을 수행하였다. 대상 의약품에 펩티드 N-탈당쇄효소 F (PNGase F)를 처리하여 N-glycan을 유리시킨 후, 유리된 N-glycan에 2-아미노벤즈아미드 (2-AB, 2-aminobenzamide) 형광 표지 (fluorescence labeling)를 한 다음, 고체상 추출 (SPE, solid phase extraction)을 이용하여 2-AB 표지된 N-glycan 혼합물 (mixture)을 분리 정제 하였다. 분리 정제된2-AB 표지된N-glycan mixture를 고성능액체크로마토그래피-친수성 상호작용 액체크로마토그래피법 (HPLC-HILIC, high performance liquid chromatography-hydrophilic interaction liquid chromatography)을 이용하여 분리하고, 연결된 형광검출기 (FLD, fluorescence detector)와 질량분석기 (MS, mass spectrometry)로 분석하였다. 분석 과정 시 각 피크의 머무름 시간 (retention time, RT, min)에 해당하는 당 단위 값 (glucose unit)을 구하기 위하여 2-AB 표지된 당 사다리 (2-AB labeled dextran ladder)를 분석하였다. 2-AB 표지된N-glycan의 구조 분석을 위하여 glucose unit과 online database와 비교하여 얻은 구조와, Q-TOF-MS를 통해 얻은 각 피크의 정확한 분자량 (이론값 대비 오차범위0.01 Da 미만)에 대한 정보, 그리고 하나 이상의 엑소글라이코시다아제 (exoglycosidase)를 동시에 처리했을 때 나타난 피크 면적 변화에 대한 정보들을 모두 조합하여 N-glycan의 구조분석을 수행하였다. 3회 반복실험을 하여 구조가 규명된 각 피크 면적에 대한 상대정량값 (relative peak intensity, %)의 평균표준편차 (relative intensity, RSD, %)값을 구하여 본 분석법의 재현성을 검증하였다 (RSD < 10%).