Characterization and evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae isolated from Nuruk for baking

Abstract

제빵과정에서 발효의 스타터로 사용되는 효모는 빵의 품질을 결정하는 주요 인자이다. 본 연구에서 사용한 Saccharomyces cerevisiae SPC-SNU 70-1은 누룩으로부터 분리한 신규의 효모로서, 발효취가 적고 담백한 풍미와 더불어 부드러운 식감을 내는 등 제빵 특성이 우수하다. 그러나 반죽에 설탕함량이 적은 당 0%, 당 8% 반죽에서는 가스 발생량이 충분하지만, 설탕함량이 많은 당 20% 반죽에서는 그렇지 못하다. 그렇기 때문에 SPC-SNU 70-1 균주의 다양한 활용을 위해 고농도 당 발효 조건에서의 발효능을 개선할 필요가 있다. 이를 해결하기 위해 선행연구자에 의해 진화 공학적인 방법으로 균주가 개량되었다. 개량된 균주의 향상된 형질의 유전적 원인을 찾기 위해 기존 효모와 개량된 효모의 전체유전자를 비교 분석하였고 총 5726개의 ORF 중 3922개에서 변화가 일어났다. 아미노산 수준에서 변화가 일어난 유전자 중 고당내성과 관련된 후보 유전자를 선정하였다. 자당효소와 관련된 SUC2, 프롤린 축적과 관련된 PUT1 그리고 트레할로스 축적과 관련된 NTH1을 후보유전자로 선정하였다. 선정된 후보유전자를 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 해당 유전자를 제거한 다음 가스 발생량을 측정하고 대사산물을 분석함으로 형질을 분석하였다. 그 결과 SUC2유전자를 제거한 균주의 경우, 자당효소의 활성이 0에 가까이 감소하였으며, 자당효소를 활용하는 초기의 가스발생량과 전체적인 가스발생량이 감소하였다. PUT1유전자를 제거한 균주의 경우, 프롤린이 5배 가량 더 축적되었고, 반죽의 발효가 진행되는 초기 0에서 4시간 사이에 가스발생량이 향상하였다. NTH1 유전자를 제거한 경우, 트레할로스 축적은 5배 가량 증가하였지만, 가스발생량에는 변화가 없었다. 트레할로스와 프롤린 축적을 동시에 상승시켰을 때의 변화되는 형질을 확인하기 위해 NTH1 유전자와 PUT1 유전자를 동시에 삭제한 후 가스발생량을 측정한 결과, PUT1을 단독으로 제거했을 때에 비해 가스발생량이 향상하였고 가스발생력이 후반까지 지속되었다. 현재 제빵용 반죽은 냉동상태로 운반되고 있어, 반죽을 해동하게 되면 얼음 결정이 녹으면서 빵 반죽의 글루텐 막을 손상시켜 수분을 유출시킨다는 문제를 가지고 있다. 따라서 반죽을 냉동이 아닌 냉장 상태로 운반할 필요성이 대두되었다. 그러나 냉장 상태로 운반하게 되면 이 역시 운반 도중 발효가 진행되어 빵이 부풀 수 있다는 문제가 있어 냉장 상태에서 발효력이 낮고 빵 발효가 일어나는 30 °C 에서는 발효력을 유지하는 균주의 필요성이 대두되었다. 이러한 특징을 가지는 균주를 구축하기 위해 진화 공학적인 방법으로 균주 개량을 시도하였다. 제빵용 효모는 빵과 함께 직접 섭취하기 때문에 유전자 조작기술이 아닌 자연적인 진화를 통한 균주 개량이 요구된다. 따라서 40 °C 환경에서 70 차례 계대 배양을 수행하여 고온에서의 생존능력 평가와 저온에서 가스발생량 측정을 통해 10 °C에서 기존 균주 대비 가스발생량이 50% 감소한 C70-2균주를 선별하였다.

A bakers yeast, Saccharomyces cerevisiae, used as a starter in fermentation during a baking process is the main determinant of bread quality. S. cerevisiae SPC-SNU 70-1 isolated from Nuruk has excellent fermentation characteristics such as good leavening ability, generating volatile organic acids which affect a mild flavor and delay of the aging of bread. However, the above yeast is not suitable for the fermentation in sweet dough (20% sucrose) due to its weak high-sucrose tolerance. To solve this problem, SPC-SNU 70-1 was evolutionary engineered previously. To find the genetic causes of the improved traits, the whole genome sequences of the parental strain is compared with the SPC-SNU suc50. The De novo genome assembly sequence of SPC-SNU 70-1 was aligned with the engineered strain, SPC-SNU suc50 and variant sites were found out by assemblytics. As a result of the analysis, the mutation occurred in 3922 ORFs out of 5726 ORFs. Among the genes that have changed at an amino acid level, three genes (SUC2, PUT1, NTH1) which are related to high-sucrose tolerance were selected as candidate genes. SUC2 is the major gene coding for invertase that catalyzes the hydrolysis of sucrose into fructose and glucose. PUT1 is coding for proline dehydrogenase. NTH1 is coding for neutral trehalase. The three genes were disrupted by using a CRISPR-Cas9 system and the resulting traits were analyzed by measuring gas production and the metabolites. In case of the SUC2-deleted strain, the activity of invertase was reduced to close to zero, and gas production was reduced in sweet dough as well. Invertase affects high-sucrose resistance, but a certain level is needed to have a positive effect. For the PUT1 gene-deleted strain, the amount of intracellular proline has increased by 4.97 times and the initial gas generation (0 h to 4 h) has increased. For the NTH1 gene-deleted strain, trehalose increased by 5.29 times, but there was no significant difference in gas production. For both NTH1 and PUT1 genes deleted strain, gas production increased compared with the PUT1 disrupted strain and fermenability maintained up to 10 hours. To summarize, proline accumulation enhances the fermentability in high-sucrose dough and has a synergistic effect with trehalose accumulation on increasing the fermentation ability in high-sucrose dough. Currently, baking dough is transported in a frozen state. When the ice crystal in dough melts, there can be a problem that gluten membrane is damaged, thereby causing water to leak out. Therefore, the need to transport the dough in a refrigerated state rather than a frozen state is raised. When transported in a refrigerated state, the bread dough still ferments during transportation. Thus the need for a cold-sensitive strain that has a low leavening ability at a refrigerated temperature (-4 °C) with maintaining fermentability at 30 °C is raised. To construct a cold-sensitive strain, SPC-SNU 70-1 was engineered by adaptive evolution. 70th serial subcultures were carried out at 40 °C to select the C70-2 strain whose gas production was reduced by 50% compared to the parental strain at 10 °C. Gas production of the C70-2 strain was maintained at 30 °C, suggesting the applicability of the C70-2 strain to transportation of bread dough in a refrigerated state.