Studies on application of spermatogonial stem cell for quail genome modification

Abstract

조류는 모델 동물로써 발생학 연구, 질병 저항성 그리고 생체 반응기 모델 등 다양한 응용 가능성을 갖고 있고, 이러한 가능성 때문에 오래전부터 연구되어왔다. 이러한 상황에서 생식선 키메라와 형질전환 조류를 생산하는 것은 매우 가치 있는 연구였고, 조류에서 생식선 키메라와 형질전환을 유도하려는 일련의 연구들이 활발하게 보고되었다. 특히, 닭의 생리적인 특성과 매년 수백 개 이상의 알을 산란한다는 생식 특성 덕분에 조류 형질전환 연구에서 가장 중점적으로 연구되었다. 특히, 조류 형질전환 연구의 중심에서, 닭의 생식선 전이 줄기세포 (germline competent stem cell) 의 한 종류인, 원시생식세포 (primordial germ cell) 에 대한 연구가 활발했으며, 체외에서 장기 배양하는데 성공하였다. 닭을 제외한 다른 조류종에서도 원시생식세포를 분리하고 배양하기 위한 연구가 있었지만, 확보할 수 있는 세포의 수가 매우 적고, 장기간의 체외 배양도 불가능한 수준이었다. 따라서 생식선 키메라 또는 형질전환 조류를 생산하기 위해서 원시생식세포를 대체할 수 있는 다른 종류의 생식선 전이 줄기세포에 대한 연구가 필요하였고, 비교적 포유동물에서 많이 연구된 성체 줄기세포의 한 종류인 정소 줄기세포에 대한 연구가 조류에서도 요구되었다. 본 연구에서는 밀도 구배 원심분리 기법을 이용하여 메추리의 정소세포로부터 정소 줄기세포를 농축시켰고, 농축된 정소 줄기세포를 메추리의 정소에 수술적 기법을 통해 주입함으로써 생식선 키메라를 효과적으로 생산할 수 있었다. 또한, 메추리의 생식선 전이 줄기세포에 아데노바이러스를 사용하여 유전자 표적 편집 기술 (programmable genome editing platform) 의 일종인 CRISPR/Cas9 system 을 도입하였고, 효과적으로 생식선 줄기세포 내에서 효과적으로 유전자 변형을 유도하였다.

첫 번째 연구에서는 메추리 정소줄기세포를 Ficoll-Paque PLUS (Ficoll), Percoll, sucrose 용액에서 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리하였고, qRT-PCR을 통해서 정소 줄기세포 특이적 유전자 (GFRA1, ITGA6, and ITGB1) 와 전분화능 관련 유전자 (NANOG and POUV) 의 발현을 정량 하였다. 흥미롭게도, 세 가지 실험군 모두 상층에 분리된 세포에서 높은 유전자 발현 양상을 보였으며, Ficoll에 의해 분리된 상층 세포에서 가장 높은 발현을 확인하였다. 이어서 RNA probe hybridzation과 투과전자현미경을 통해 Ficoll 상층 세포에 정소 줄기세포가 농축되어있음을 확인하였다. 생식선 전이 (germline transmission) 능력을 검증하기 위해 농축된 정소 줄기세포를 buslufan 처리한 메추리의 정소에 수술적 기법으로 주입하였고, 검정 교배를 통해 생식선 전이 효율을 측정하였다. 결과적으로 정소세포를 주입한 대조군 (1.4 ± 1.4 %) 에 비교하여 정소줄기세포를 농축 시킨 후 주입한 실험군 (8.4 ± 1.7 %)에서 약 6배 높은 생식선 전이 효율을 확인하였다.

두 번째 연구에서는, 분리된 생식선 전이 줄기세포의 유전자 적중 편집을 유도하기 위해CRISPR/Cas9 system을 체외에서 도입하였다. 먼저, 아데노바이러스의 외래 유전자 전달 효과를 메추리의 배아 생식선 세포와 농축된 정소줄기세포에서 검증하였다. 또한 세포와 바이러스 사이의 결합력을 증진시키기 위해 중합체의 일종인 poly-L-lysine 을 첨가하여 전달 효과를 최적화시켰다. 이렇게 아데노바이러스를 통해 GFP 유전자가 도입된 원시생식세포를 표면 특이적 마커로 분리하고, 정소 줄기세포와 함께 생식세포 특이적 유전자 (VASA, DAZL), 전분화능 관련 유전자 (NANOG, POUV), 정소줄기세포 특이적 유전자 (GFRA1, ITGA6, ITGB1) 의 발현을 검증하였다. 또한 면역 세포 화학 기법을 통해 DAZL유전자를 발현하는 세포에서 아데노바이러스를 통해 들어온 GFP 유전자가 발현되는 것을 확인하였다. 마지막으로, CRISPR/Cas9 system을 전달하기 위한 아데노바이러스를 제작하였고, 메추리와 생식선 전이 줄기세포에서 Transferrin 과 Hoxb13 유전자를 적중하여 변형을 유도하였다. T7E1 분석과 염기서열 확인을 통해 적중부위에서 염기서열 변형이 일어난 것을 확인하였고, 메추리의 생식선 전이 줄기세포에서 약 33.3 % 의 효율로 유전자 편집이 일어남을 확인했다. 같은 방법을 닭의 생식선 전이 줄기세포에도 적용하였지만, 아데노바이러스의 전달 효율이 매우 낮았다.

결과적으로, 본 연구에서는 Ficoll에 의한 밀도 구배 원심분리를 통해서 메추리의 정소 줄기세포를 농축하는데 성공하였으며, 농축된 정소줄기세포의 정소세포로의 이식을 통해 생식선 전이 능력이 향상됨을 검증하였다. 또한 체외에서 아데노바이러스를 통해 CRISPR/Cas9 system을 메추리 생식선 전이 줄기세포에 효과적으로 전달하였고, 적중하고자한 부위에서 유전자 염기서열의 변형을 확인하였다. 본 연구에서 밝힌 정소줄기세포 농축 기법과 아데노바이러스를 통한 유전자 조절 기법은 여러 멸종위기 조류 종의 복원과 유전자 조절 조류의 생산 연구에 대한 기초 자료로써 기여 할 수 있다.

Avian species have been considered as one of the most valuable animal models for various applications including developmental biology, disease resistance model and bioreactor. In this circumstance, efforts for generating germline chimeric and transgenic birds have been studied for a long time by a number of investigators. In particular, chicken has been focused as a useful bioreactor model with their high egg production rate. Even, primordial germ cell (PGC), which is one of germline competent stem cells, have been well investigated while long-term in vitro culture has been established in chicken. However, it was hard to apply chicken primordial germ cell culture system to other avian species due to lack of cell sources and short in vitro culture duration. Thus, it is necessary to develop alternative germline competent stem cell mediated germline chimeric and transgenic bird generation in other avian species. In this study, we established simple and practical density gradient centrifugation mediated spermatogonial stem cell (SSC) enrichment method, and verified feasibility and enhancement of enriched spermatogonial stem cells germline transmission efficiency in quail. Furthermore, we induced in vitro genome modification in isolated and enriched quail germline competent stem cells with adenoviral vector mediated CRISPR/Cas9 genome editing tool.

From the first study, we enriched quail SSC by density gradient centrifugation methods with Ficoll-Paque PLUS (Ficoll), Percoll and sucrose solutions. To evaluate enrichment of each fractions, expression levels of SSC-specific genes (GFRA1, ITGA6, and ITGB1) and pluripotency genes (NANOG and POUV) were examined by qRT-PCR. Interestingly, cells from upper fractions in most of density gradients showed significantly higher gene expressions. In addition, qRT-PCR results revealed that cells from upper fractions in Ficoll density gradient showed the highest SSC-specific and pluripotency marker expression. Then we confirmed SSC enriched fractions by RNA hybridization and TEM image. Subsequently, SSC enriched fractions were transplanted into busulfan treated quail testis, and PKH-26 labeled donor cells were detected from the testicular tubules. We performed testcross analysis for verifying germline transmission efficiency. As a results, SSC enriched fraction transplanted quail produced donor-derived sperm and progeny, and its efficiency (8.4 ± 1.7 %) showed significantly 6 times higher than that of whole testicular cells transplanted group (1.4 ± 1.4 %).

Finally, we introduced CRISPR/Cas9 system into quail germline competent stem cells for inducing in vitro genomic DNA modification. We transduced embryonic gonadal cells and enriched SSC by adenoviral and adeno-associated viral vectors, and only adenoviral vector showed positive signals in all quail cells. Then we optimized adenoviral transduction with poly-L-lysine adding, and 1 µg/mL concentration of poly-L-lysine mostly optimized adenoviral transduction in all quail cells. For characterizing adenoviral vector transduced cells, we identified germ cell specific (VASA, DAZL), pluripotency (NANOG, POUV) and germline stem cell specific (GFRA1, ITGA6, ITGB1) markers from quail PGC, SSC and QM7 cell line. Finally, we constructed adenoviral vector delivering CRISPR/Cas9 targeting for Transferrin and Hoxb13 gene, and induced genome modification in quail germline competent stem cells. T7E1 assay and sequencing analysis revealed that CRISPR/Cas9 delivery with adenoviral vector induced about 33.3 % of mutation at genomic DNA of quail germline competent stem cells. However, there was no positive signal with adenoviral and adeno-associated viral vectors in chicken germline competent stem cells.

Collectively, these results suggested that Ficoll density gradient solution can be used as a simple and practical method for SSC enrichment, and this method could be applied for bird conservation, restoration and even transgenic quail researches. In addition, adenoviral vector mediated CRIPSR/Cas9 delivering is efficient in quail germline competent stem cells, but not in chicken germline competent stem cells. Thus, we can expect to apply adenoviral vector with CRISPR/Cas9 system via in vitro even in vivo approaches for generating targeted genome edited quail.