Associations of Dietary Patterns with Subpopulations of PBMCs and Their Transcriptomic Profiles in the Korean Elderly

Abstract

As human life expectancy has been increased, there has been a growing interest in the aging of immune system, which is associated with a variety of age-related dis-eases. To date, it has been established that the diet can regulate the immune system by several mechanisms. Recently, in a diet-related epidemiologic research, analyz-ing habitual dietary patterns based on the food groups has been considered as a comprehensive tool to consider complex combinations of food groups. However, little human research has investigated the associations between dietary patterns and immune function of free-living elderly, and the fundamental mechanisms have not been completely understood. In this study, to elucidate the associations of the die-tary patterns with populations and gene expressions of circulating immune cells in the elderly, we conducted a cross-sectional study in which the community-dwelling elderly (≥ 65 years) participated. We recruited 201 volunteers living in Seoul City and Seongnam City and screened the volunteers to select the elderly who had abili-ties to control basic needs and to perform more complex activities for independent life according to the Activities of Daily Living (ADL) and Instrumental-ADL (I-ADL). We collected one 24-hour recall and two-day food diaries of each subject. Food items were categorized into 15 food groups based on the Korean Nutrition Society database, and the intakes of food group were converted into percentages of daily energy intakes. The 3-day averages of intake of each food group were used to identify dietary patterns by k-means clustering. We isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) which include circulating lymphocytes, monocytes and dendritic cells (DCs) from whole blood for fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis and next-generation sequencing (NGS) of mRNA. Serum C-reactive protein (CRP) concentrations were measured by enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA). As a result, 92 elderlies completed this cross-sectional study, and cluster analysis identified two dietary patterns of the subjects: Cluster 1 (n = 60) characterized by higher intake of cereals; and Cluster 2 (n = 32) charac-terized by higher intakes of animal foods including meats and their products, fishes and shellfishes, eggs, and milk and their products, as well as higher intakes of potatoes and starches and beverage, tea and alcohol. Macronutrients compositions significantly differed in the subjects of two clusters, but the average energy intakes and BMI did not differ. Comparison of PBMCs subpopulation sug-gested that these two clusters significantly differed in T cells and NK cells subpop-ulations. Subjects in Cluster 2 had fewer CD4+ T cells (for Cluster 1, 23.83 ± 1.28%; for Cluster 2, 15.77 ± 2.41%; p < 0.01) and more CD8+ T cells (For Cluster 1, 29.80 ± 1.08%; for Cluster 2, 35.50 ± 2.03%; p = 0.02) and CD56high NK cells (for Cluster 1, 0.71 ± 0.11%; for Cluster 2, 1.37 ± 0.20%; p < 0.01). Subgroup analysis suggested that CD8+ T cell frequency could be different according to the BMI. In addition, mRNA-sequencing analysis of PBMCs identified 957 differen-tially expressed genes (DEGs) between two clusters. These genes are mainly in-volved in innate immunity, such as binding, uptake and activation of lipopolysac-charide (LPS). Also, we observed higher expressions of genes related to TLR sig-naling, DC maturation, and antibacterial response in Cluster 2. Linear regression indicated that expressions of the TLR2, TLR4, TLR8, and CD14 had a negative lin-ear relationship with intakes of cereals (for TLR2, β = -0.62, p = 0.03; for TLR4, β = -0.61, p = 0.04; for TLR8, β = -0.76, p < 0.01; for CD14, β = -0.81, p < 0.01) and positive linear relationship with meats and their products intake (for TLR2, β = 0.59, p = 0.04; for TLR4, β = 0.65, p = 0.02; for TLR8, β = 0.69, p = 0.01; for CD14, β = 0.86, p < 0.01). In addition, the serum CRP concentration was significantly higher in Cluster 2 than in Cluster 1 (for Cluster 1, 0.59 ± 0.23 mg/L; for Cluster 2, 1.60 ± 0.43 mg/L; p = 0.04). It may imply that subjects in Cluster 2 have higher level of inflammation than subjects in Cluster 1. In conclusion, diet rich in animal food was associated with the lower CD4/CD8 ratio (for Cluster 1, 0.87 ± 0.06; for Cluster 2, 0.45 ± 0.11; p < 0.01) and higher frequency of CD56high NK cells with higher ex-pressions of genes involved in infection and inflammation of PBMCs as well as higher concentrations of serum CRP. These results suggest that diet rich in animal food might be associated with the higher susceptibility to infection and chronic inflammation in the community-dwelling elderly. These results provide an insight into the fundamental mechanisms of dietary effects on immune function in the el-derly.

전세계적으로 노인 인구가 증가하면서, 다양한 노인성 질환과 연관되는 면역계의 노화에 대한 관심이 늘고 있다. 이에 따라 면역 기능과 식사와의 관련성에 대해 많은 연구가 이루어졌으며, 특히 최근에는 단일적인 식이 요인이 아닌 전반적인 식품군 섭취량을 반영한 일상적인 식사 패턴 연구의 필요성이 대두되고 있다. 그러나 현재까지 노인을 대상으로, 특히 지역 사회에서 독립적인 생활을 하고 있는 노인들을 대상으로 식사 섭취 패턴과 면역 기능의 연관성을 규명한 연구는 부족한 실정이며, 관련된 기전이 아직 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 단면 연구를 통해 노인의 전반적인 식사 패턴을 분류하고, 식사 패턴과 면역 세포의 분포와 유전자 발현과의 연관성을 살펴보고자 하였다. 서울특별시와 경기도 성남시에서 모집 공고를 통해 65세 이상의 노인 총 201명을 모집하였고, 한국형 일상생활활동 측정도구(ADL) 및 도구적 일상생활활동 측정도구(I-ADL)를 통해 독립적인 일상생활이 가능한 노인을 선별하였다. 총 92명의 노인이 1일의 24시간 회상법과 2일의 식사기록지 작성을 수행하여 3일의 식사 섭취 기록을 제출하였다. 수집된 식사 섭취 기록에 나타난 식품들을 한국영양학회의 데이터베이스에 따라 15개의 식품군으로 분류하였고, 각 식품군 별 섭취량을 하루 총 에너지 섭취량 대비 백분율로 환산하였다. 3일간의 식품군 섭취량 백분율의 평균을 계산하여, k-means clustering 분석을 통해 식사 섭취 패턴을 분류하였다. 또한, 혈액에서 순환하고 있는 림프구와 단핵구 및 수지상세포를 포함하는 말초혈액단핵세포를 분리하여, fluorescence-activated cell sorting (FACS) 분석과 RNA-sequencing 분석을 진행하였다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 통해 혈청의 C-reactive protein 농도를 측정하였다. 본 연구 결과, 노인기 식사 섭취 패턴은 크게 두 개의 cluster로 구분되었다. Cluster 1 (60명)은 곡류 및 그 제품군의 섭취량이 많았으며, Cluster 2 (32명)는 감자 및 그 제품군과 음료, 차류, 및 주류를 비롯해, 동물성 식품인 육류 및 그 제품군, 난류군, 어패류 및 그 제품군과 우유류 및 그 제품군의 섭취량이 많았다. 두 그룹에서 다량 영양소의 구성도 유의한 차이를 보였으며, 특히 Cluster 2에서 더 많은 동물성 단백질과 동물성 지방을 섭취하고 있었다. 그러나 평균 에너지 섭취량과 체질량지수는 다르지 않았다. 말초혈액단핵세포의 분포를 일반화선형모형으로 비교한 결과, 두 그룹은 T 세포와 NK 세포의 조성에서 유의한 차이를 보였다. Cluster 1의 피험자들과 비교했을 때, Cluster 2의 피험자들에게서 CD4+ T 세포는 더 적게 발견되었으며 (Cluster 1: 23.83 ± 1.28%; Cluster 2: 15.77 ± 2.41%; p < 0.01), CD8+ T 세포 (Cluster 1: 29.80 ± 1.08%; Cluster 2: 35.50 ± 2.03%; p = 0.02)와 CD56high NK 세포 (Clus-ter 1: 0.71 ± 0.11%; Cluster 2: 1.37 ± 0.20%; p < 0.01)는 더 많이 발견되었다. 하위 그룹 분석 결과, 체질량지수에 따라 CD8+ T 세포 분포가 다르게 나타났다. 말초혈액단핵세포의 전사체 분석 결과, 총 957개의 유전자의 발현이 두 그룹에서 유의하게 달랐다. 이 유전자들은 주로 lipopolysaccha-ride (LPS)의 결합 및 활성화 등에 관여하는 선천성 면역 반응과 관련된 유전자들이었으며, 특히 Toll-like receptor (TLR) signaling, 수지상세포의 성숙 및 항박테리아 반응과 관련한 유전자들이 Cluster 2에서 높게 발현됨을 확인할 수 있었다. 이때 선형회귀분석을 통해 TLR2, TLR4, TLR8 및 CD14의 발현이 곡류 및 그 제품군 섭취와 음의 선형 관계를 (TLR2: β = -0.62, p = 0.03; TLR4: β = -0.61, p = 0.04; TLR8: β = -0.76, p < 0.01; CD14: β = -0.81, p < 0.01), 그리고 육류 및 그 제품군 섭취와 양의 선형 관계를 가진다는 것을 확인할 수 있었다 (TLR2: β = 0.59, p = 0.04; TLR4: β = 0.65, p = 0.02; TLR8: β = 0.69, p = 0.01; CD14: β = 0.86, p < 0.01). 여기에, 혈청 C-reactive protein의 농도가 Cluster 2에서 더 높게 관찰되었다 (Cluster 1: 0.59 ± 0.23 mg/L; Cluster 2: 1.60 ± 0.43 mg/L; p = 0.04). 결론적으로, 동물성 식품을 많이 섭취하는 식사 패턴은 더 낮은 CD4/CD8 비율 (Cluster 1: 0.84 ± 0.40; Cluster 2: 0.55 ± 0.30; p < 0.01)과 더 많은 CD56high NK 세포와 연관되어 있었고, 선천적 면역 반응 및 염증 반응에 관여하는 유전자가 더 높게 발현되고 있었으며, 높은 혈청 C-reactive protein 농도를 보였다. 이는 동물성 식품이 풍부한 식사 섭취 패턴이 노인의 높은 감염 감수성 및 지속적인 염증 반응과 연관될 수 있음을 나타낸다. 본 연구 결과는 식사 섭취 패턴이 노인의 면역 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 근본적인 메커니즘을 구축하는데 기여할 수 있다.