Effects of Selenium and Zinc Enriched Lactobacillus plantarum SeZi on Blood Selenium and Zinc Concentrations, Antioxidant Capacities and Intestinal Flora in ICR Mouse

Abstract

셀레늄과 아연은 항산화능을 가진 필수 미량원소이다. 본 연구의 목적은 셀레늄과 아연이 풍부한 유산균을 선별하고 이를 마우스에 섭취시켰을 때 혈액 내 셀레늄과 아연의 농도, 항산화 능력 및 장내균총 분포에 미치는 영향을 연구하는 것이다. 본 연구에서 사용된 300개의 균주 중에서 셀레늄과 아연을 가장 많이 축적한 균주는 Lactobacillus plantarum이 었다. 따라서 이 균주를 Lacto- bacillus plantarum SeZi로 명명하였다. 먼저, 셀레늄과 아연에 대한 저항성과 축적능력에 관련된 유전자 정보를 식별하기 위해 L. plantarum SeZi를 대상으로 whole genome sequencing을 수행하였다. L. plantarum SeZi의 genome에서 무기 셀레늄인 selenite의 섭취와 관련된 단백질인 DedA , CysA , 아연 섭취 조절 단백질인 ZUR, ABC transporter와 내성 관련 단백질인 P-type ATPase family, cation diffusion facilitator family, MerR family의 유전자들이 발견되었다. 해당 균이 지닌 셀레늄과 아연에 대한 저항성과 축적능력은 아마도 이러한 유전자들이 존재하기 때문인 것으로 사료된다. 해당 균의 안전성을 평가해보았을 때, L. plantarum SeZi는 암모니아를 생산하지 않았고 용혈성을 나타내지 않았으며 항생제 내성을 전달할 수 없었다. 다음으로 L. plantarum SeZi를 섭취하였을 때 체내에 미치는 영향을 확인하고자 동물실험을 수행하였다. 수컷 ICR 마우스를 사용하였으며 32마리를 무작위로 4개 군으로 나누었다. C군은 일반 식이를 먹인 군이며, SZ군은 Na2SeO3와 ZnSO4·7H2O를 사료에 첨가한 군, L군은 L. plantarum SeZi를 사료에 첨가한 군, LSZ군은 셀레늄과 아연을 함유한 L. plantarum SeZi를 사료에 첨가한 군이다. 이 중 SZ군과 LSZ군의 사료에 첨가된 셀레늄과 아연의 함량이 같았고, L군과 LSZ군의 사료에 첨가된 유산균의 양이 동일하였다. 30일 동안 4개 군 사이의 마우스 체중에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 사료에 아연과 셀레늄을 첨가한 실험군 (SZ군와 LSZ군) 마우스의 혈중 아연과 셀레늄 함량은 아연과 셀레늄을 첨가하지 않은 군보다 높았다. 항산화 실험 결과에서는 SZ군과 LSZ 군의 glutathione peroxidase와 superoxide dismutase의 활성이 증가하였고 malondialdehyde 수준이 감소하였다. 다음으로 마우스의 변을 대상으로 장내균총 분석을 수행하였다. Phylum 수준의 경우, 실험 시작 0일째에는 실험군 간의 Firmicutes와 Bacteroidetes의 비율이 큰 차이가 없었던 반면, 30일이 지난 후 L. plantarum SeZi를 섭취한 군 (L군과 LSZ군)에에서의 Firmicutes와 Bacteroidetes의 비율은 다른 군들에 비해 유의적으로 증가하였다. Genus 수준의 경우, 30일 동안 다른 군들에 비해 L군과 LSZ군의 Lactobacillus abundance가 증가하였고 Bacteroides abundance가 감소하였다. 본 연구에서 L. plantarum SeZi가 셀레늄과 아연에 대한 높은 내성 및 축적 능력을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 해당 균의 안전성 평가에서 L. plantarum SeZi는 암모니아 생산 시험, 용혈 시험 및 항생제 민감성 시험에서 유해성이 관찰되지 않았다. 동물실험에서 L. plantarum SeZi는 혈중 셀레늄과 아연의 농도를 증가시키고 항산화 능력을 향상시켰으며, 장내균총에서 Lactobacillus의 증가를 촉진하고 Bacteroides를 감소시키는 유익한 변화를 가져왔다.

Selenium and Zinc are the trace minerals with multiple biological functions. However, the possible health benefits of the combined administration of dietary selenium and zinc have not been studied extensively. The aim of this study was to screen and prepare selenium- and zinc-enriched probiotic and investigate their effect on blood selenium and zinc concentrations, antioxidant capacities, and intestinal microflora in mice. After screening out and identifying 300 strains from human intestinal bacteria, it was found that Lactobacillus plantarum SeZi showed relative high tolerance to Na2SeO3 and ZnSO4∙7H2O as well as the best bioaccumulation capabilities of selenium and zinc. To further assess the characteristics of this strain, the probiotic powder was prepared as follow. L. plantarum SeZi (1%) was inoculated and cultured in de Man Rogosa and Sharpe (MRS) broth with addition of 0.01 mM Na2SeO3 and 3.5 mM ZnSO4∙7H2O at 37℃ for 24 h under anaerobic conditions. The dry cell mass of the product was 2.5 g/l and L. plantarum SeZi biomass was 11.6 lg CFU/g. The inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) was used to measure the concentrations of zinc and selenium. The results showed that 55.2 mg/kg selenium and 306.2 mg/kg zinc were detected in L. plantarum SeZi. It was detected the genes coding these proteins including DedA, CysA, ZUR, ABC transporter, P-type ATPase family, cation diffusion facilitator family and MerR family from the whole genome sequencing of L. plantarum SeZi via Illumina MiSeq. The relatively high resistance and accumulation ability of L. plantarum SeZi with regard to selenium and zinc might result from the genes coding these proteins. Furthermore, safety evaluations of L. plantarum SeZi were performed via ammonia production test, hemolytic test and antibiotic susceptibility test. The results showed that L. plantarum SeZi didnt show ammonia production, hemolytic activity, nor transferable resistances. Thirty-two male ICR mice were randomly assigned to four groups for a 30-day study. They were provided with a normal diet (C group) or a diet supplemented with Na2SeO3 and ZnSO4∙7H2O (SZ group), L. plantarum SeZi (L group) or SeZn-enriched L. plantarum SeZi (LSZ group), respectively. Blood samples were collected immediately after scarification. Fecal samples were collected on day 0 and day 30. Compared with C group and L group, the concentrations of Se and Zn in the blood were significantly increased in the SeZn supplement group (SZ group and LSZ group). The increase of Se and Zn concentrations subsequently led to the increased activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) and the decreased blood malondialdehyde (MDA) level in the SZ group and LSZ group (p<0.05). As for the bacterial compositions investigated via 16S metagenome, the relative abundance of Lactobacillus in the feces were significantly increased, while Bacteroides were significantly decreased in the L. plantarum SeZi supplemented group (L group and LSZ group) (p< 0.05).