Construction of Recombinant Bifidobacterium bifidum BGN4 Expressing Bifidobacterial β-Galactosidase Gene and Application for Improvement of Lactose Intolerance

Abstract

본 연구는 분자 유전학적 기법을 통해 Bifidobacterium 유래 β-galactosidase를 고발현하는 재조합 bifidobacteria를 개발하여 이를 in vitro lactose 가수분해 및 in vivo lactose intolerance (LI) 동물연구에 활용해 Bifidobacterium 유래 β-galactosidase의 활용범위를 넓히는 것을 목적으로 하였다. 또한 부수적으로, 이러한 유전자 재조합 bifidobacteria가 장차 인체에 적용될 수 있도록 현재까지 구축되지 않은 bifidobacteria용 food-grade vector를 위한 selection marker를 개발하고자 하였다. β-galactosidase 고발현 bifidobacteria의 개발에 앞서, bifidobacteria에 β-galactosidase gene을 효과적으로 도입하기 위해 bifidobacteria의 낮은 electroporation 매개 transformation 효율을 재현성있게 높은 수준으로 개선하기 위한 사전 연구가 수행되었다. 실험 결과, cell wall weakening agent (NaCl)와 cell membrane permeabilizing agent (Ethanol)를 적용하고 electrical parameter를 2.5 ㎸에서 3 ㎸로 조정하였을 때 본 연구의 transformation host로 사용된 B. bifidum BGN4의 transformation 효율이 10^3에서 10^5 CFU / ㎍ DNA로 72배 높아졌다. 최적화된 방법은 다른 Bifidobacterium species에도 적용할 수 있었다. 이제 본 연구로 돌아가 Bifidobacterium 유래 β-galactosidase gene을 이용하여 β-galactosidase 고발현 bifidobacteria를 개발하기 위해, 가장 높은 수준의 β-galactosidase 활성을 갖는 Bifidobacterium strain 중 하나인 B. longum RD47의 β-galactosidase gene을 여러 bifidobacteria 유래 promoter들과 조합하여 BGN4에서 발현시켰다. 개발된 재조합 bifidobacteria 중 BGN4-G1은 BGN4보다 2.5 - 4.2 배 높고, RD47보다 4.3 - 9.6 배 높은 β-galactosidase 활성을 나타냈다. 또한 자연에 존재하는 35개 유산균들과 비교하였을 때에도 BGN4-G1의 효소 활성이 월등히 뛰어났다. 시판우유와 BGN4-G1을 반응시켰을 때, BGN4-G1은 발효되면서 기존 발효유의 약 2배에 달하는 lactose 제거율을 보였다. 시판우유와 BGN4-G1의 crude enzyme extract를 반응시켰을 때에는 BGN4-G1의 β-galactosidase가 2시간 동안 51%의 유당을 가수분해하였다. 이는 50 ㎍의 단백질을 함유하는 crude enzyme extract를 첨가하였을 때의 결과였기 때문에 crude enzyme extract의 양을 증가시킬 경우 더 큰 효과가 기대된다. 이들 결과들로 미루어 보아, his-tag을 붙여 BGN4-G1으로부터 β-galactosidase를 정제하면 이를 lactose-free milk나 fermented milk 생산에 활용할 수 있을 것으로 사료된다. Lactose intolerance (LI)는 소화관에서 β-galactosidase가 결여되거나 부족하여 발생하는 질병으로, 세계 성인 인구의 약 75%가 겪고 있기 때문에 공중보건관리 측면에서 전세계적인 문제로 간주된다. 최근, Bifidobacterium species에 속하는 균주가 LI의 잠재적인 치료제로서 주목받고 있다. 그러나 Bifidobacterium이 LI에 효과가 있는지 없는지에 대하여 이전 연구들에서 서로 상반된 결과들이 도출되어왔다. 우리는 이러한 상반된 결과의 원인이 실험에 사용된 균주 간의 β-galactosidase 활성 차이에 있다는 가설을 세웠고, 이를 입증하기 위해 in vivo 실험을 수행하기로 하였다. 이에 따라 β-galactosidase 저발현 bifidobacteria, wild-type bifidobacteria, β-galactosidase 고발현 bifidobacteria를 LI model mouse로 알려진 이유기 이후의 Balb/c mouse에 각각 투여함으로써 bifidobacteria의 β-galactosidase 활성이 LI 완화에 미치는 영향을 확인해보았다. 이전 실험에서 개발되었던 BGN4-G1을 β-galactosidase 고발현 bifidobacteria로, BGN4를 wild-type bifidobacteria로 사용하였으며, BGN4보다 β-galactosidase 활성이 약 3.2배 낮은 BGN4 돌연변이체인 BGN4-bgr을 개발하여 이를 β-galactosidase 저발현 bifidobacteria로 사용하였다. Balb/c 마우스를 7개의 실험군으로 그룹화하였는데 각 군은 다음과 같다. 1) wild-type BGN4 투여군, 2) BGN4-pBES2 투여군, 3) BGN4-bgr 투여군, 4) BGN4-G1 투여군, 5) LI만 유도된 untreated군, 6) LI 유도 직전에 lactase가 투여된 lactase-treated군, 7) LI가 유도되지 않은 uninduced군. 모든 mouse에 생균 용액이나 생리식염수를 2주간 경구투여 하였으며 그 후, lactose를 투여해 6시간동안 LI 증상을 관찰하였다. 실험 결과, BGN4-G1 투여군은 대변 빈도와 대변의 무게가 untreated군에 비해 현저히 감소하였고 장 운동성이 억제되었다. BGN4-G1 투여군의 LI 완화 효과는 양성대조군으로 사용된 lactase-treated군보다 더 컸으며 심지어 uninduced군의 수준에까지 도달하였다. 한편, BGN4 및 BGN4-bgr 투여군의 대변 빈도와 대변의 무게는 untreated군에 비해 감소하는 경향이 있었지만 유의한 차이는 발견되지 않았다. 장 운동성의 경우, BGN4-bgr 투여군과 달리 BGN4 투여군에서 untreated군에 비해 장 운동성이 유의적으로 억제된 결과가 나타났다. 이는 우리의 가설대로 bifidobacteria의 β-galactosidase 활성이 높아짐에 따라 LI 완화정도가 증가함을 시사한다. 이전의 연구들에서 LI는 장내 미생물군집과도 연관성을 지닌다고 보고되어왔다. 우리는 bifidobacteria의 β-galactosidase 활성에 따른 LI 완화 기전을 이러한 관점에서 조사해보고자 BGN4-bgr, BGN4, BGN4-G1 또는 생리식염수를 2주간 투여한 mouse의 대변에서 장내 미생물 분석을 실시하였다. 또한 SCFA와 lactate는 장내 미생물의 발효산물이기 때문에 이들 mouse의 맹장 내 SCFA와 lactate의 함량을 부수적으로 측정해보았다. 실험 결과, 다음과 같은 몇 가지 의미있는 결과들이 도출되었다. 1) 장 건강과 관련된 몇몇 미생물들의 비율이 bifidobacteria 투여군과 untreated군 사이에서 구분되는 경향이 있었다. 2) BGN4-G1군에서의 Bifidobacterium 비율이 BGN4 및 BGN4-bgr군에 비해 증가하는 경향이 나타났다. 3) SCFA와 lactate의 balance는 bifidobacteria 투여군과 untreated군 사이에서 구분되었다. 4) SCFA와 lactate의 변화 양상은 BGN4-bgr군을 제외한 BGN4-G1 및 BGN4군에서 비슷한 패턴을 보였다. BGN4-G1이 LI 증상을 유의적으로 완화하였기 때문에, food-grade vector를 통해 G1을 발현하는 BGN4-G1이 개발되면 LI 완화 균주로서 활용될 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다. 그러나 현재까지 bifidobacteria용 food-grade vector가 개발되지 못해 재조합 bifidobacteria들이 인체에 적용될 수 없는 실정이다. 이에 따라, 본 연구에서는 bifidobacteria용 food-grade vector 개발을 위한 selection marker로서 SOD와 catalase gene의 이용 가능성을 평가해보았다. 먼저, lactic acid bacteria 유래의 SOD 및 catalase gene을 BGN4 내에서 발현시켰으며 해당 recombinant를 BGN4-SK라 명명하였다. 그 후, BGN4-SK에서 catalase가 가장 높은 수준으로 발현될 수 있는 최적 조건과 wild-type BGN4와 BGN4-SK의 생존율이 명확하게 구분될 수 있는 H2O2 stress 조건을 탐색해보았다. 이를 적용하여 10^8 CFU의 wild-type BGN4 내에서 10^2 CFU의 BGN4-SK를 선별하는 실험을 수행해보았는데, 설정된 H2O2 stress 하에서 대부분의 균이 죽어 오직 34개의 콜로니만이 살아남았으며 그 중 2개의 콜로니가 sequencing 결과 BGN4-SK로 확인되었다. 이는 H2O2 stress에 의한 selection pressure가 대다수의 wild-type BGN4 내에서 극소수의 recombinant BGN4를 선별하는 데에 적합함을 시사한다. 본 실험은 bifidobacteria용 food-grade vector 개발을 진전시킬 수 있는 효과적인 selection marker 후보군을 찾았다는 데에 의미를 지닌다.

The aim of this study was to obtain a recombinant bifidobacteria with high β-galactosidase activity through molecular genetic techniques and apply it in vitro lactose hydrolysis and in vivo lactose-intolerance animal experiments. Incidentally, development of a selection marker for a food-grade vector for bifidobacteria was pursued to enable recombinant bifidobacteria to be used in various applications for the human body and food product in the future. Prior to the development of the β-galactosidase over-expressing bifidobacteria, a preliminary study to improve the electroporation efficiency of bifidobacteria was performed. As a result, the electroporation efficiency of B. bifidum BGN4, which was a transformation host in my study, was drastically and consistently increased from 10^3 to 10^5 CFU / ㎍ DNA. The optimized electrotransformation conditions were widely applicable to other Bifidobacterium species. Returning to the main study, to obtain β-galactosidase over-expressing bifidobacteria, the β-galactosidase gene (G1) was cloned from Bifidobacterium longum RD47 (RD47), which is one of the bifidobacterial strains with the highest level of β-galactosidase activity, with combinations of several bifidobacterial promoters and expressed in B. bifidum BGN4 (BGN4). Among the recombinant bifidobacteria, BGN4-G1 exhibited the highest β-galactosidase level, for which the hydrolytic activity was continuously 2.5 to 4.2 times higher than that of BGN4 and 4.3 to 9.6 times higher than that of RD47. The β-galactosidase activity of BGN4-G1 was exceedingly superior to that of any of the other 35 experimental lactic acid bacteria. BGN4-G1 could remove 50% of the lactose from the whole milk already at 63 h and finally 61% at 93 h. This figure is about twice the lactose removal rate of conventional fermented milk. The crude enzyme extract containing 50 ㎍ of protein from BGN4-G1 could remove 51% of the lactose in milk within 2 h. Therefore, it is believed that the purification of G1 from BGN4 by attaching a his-tag to the gene will have industrial significance, such as using it in the production of lactose-free milk or fermented milk. Lactose intolerance (LI) is a worldwide issue in terms of public health management. Recently, Bifidobacterium species has attracted attention as a potential treatment for lactase deficiency. However, contradictory results have been reported in previous studies in which bifidobacteria were effective for LI or not. I hypothesized that bifidobacteria may be effective in alleviating LI, but the reason for the contradictory results in the previous studies were due to differences in the β-galactosidase activities among Bifidobacterium strains used in the experiments. To prove the hypothesis, it was tried to verify the effect of β-galactosidase activities of bifidobacteria on LI alleviation by feeding post-weaning Balb/c mice with various version of Bifidobacterium strains with different β-galactosidase activities (β-galactosidase reduced mutant, wild-type and β-galactosidase over-expressing bifidobacteria). As a result, the LI related symptoms such as total number and total weight of feces and intestinal motility have been improved according to the increased activity of β-galactosidase of bifidobacteria. The LI alleviation effect in the BGN4-G1 administration group was greater than that in the lactase-treated group and even reached a LI-uninduced level. Meanwhile, the stool frequency and total feces weight of the BGN4 and BGN4-bgr administration groups tended to decrease compared to the untreated group, but no significant difference was found. In the case of intestinal motility, in contrast to the BGN4-bgr group, the BGN4 administration group was significantly inhibited in intestinal motility compared to the untreated group. This suggests that the LI alleviation effect is improved as the β-galactosidase activity of the bifidobacteria is increased. To explore the mechanisms for improved LI according to the β-galactosidase activity, a gut microbiome analysis was performed from the feces of the mice fed BGN4-bgr, BGN4, BGN4-G1 or NS for two weeks. As a result, some meaningful results were derived as follows: 1) The proportion of several microorganisms associated with intestinal health tended to be differentiated between the Bifidobacterium-fed groups and the untreated group, 2) The bifidobacterial proportion in the BGN4-G1 group tended to be increased compared to the other Bifidobacterium-fed groups, 3) The balance of SCFAs and lactate was differentiated between the Bifidobacterium-fed groups and the untreated group, 4) The rates for the change in SCFAs and lactate were grouped in a similar pattern in the BGN4-G1 and BGN4 groups except for the BGN4-bgr group. Because the BGN4-G1 exhibited a significant effect on LI alleviation, it is expected that BGN4-G1 can be reproduced with a food-grade vector for bifidobacteria, and it will be used as an LI treatment strain. However, food-grade vectors for bifidobacteria have not been developed yet to my knowledge, so it was decided to develop a selection marker for constructing a food-grade vector for bifidobacteria using the superoxide dismutase (SOD) and catalase genes from lactic acid bacteria as food grade selection marker. First, the SOD and catalase genes were subcloned into pBES2 with combinations of bifidobacterial promoters and a terminator and transformed into BGN4 to construct BGN4-SK. For the efficient selection of transformant using H2O2, the optimal H2O2 concentration and exposure time were investigated. As a result, when a bacterial mixture of 10^2 CFU of BGN4-SK and 10^8 CFU of wild-type BGN4 was treated with 4 mM H2O2 stress for 2 h, most of the cells were dead and only 34 colonies remained, of which 2 colonies were identified as BGN4-SK. It suggests that the selection pressure induced by H2O2 is suitable for the selection of a few recombinants BGN4 among the majority of wild-type BGN4. It is meaningful in that the SOD and catalase genes can be a candidate food grade selection marker for bifidobacteria.