Structure and Mechanism Investigation of anti-CRISPR AcrIIA1 and AcrIIA5 Proteins

Abstract

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR associated (Cas) genes constitute a prokaryotic adaptive immune system against invading phages and plasmids. To counteract this defense mechanism, phages evolved Anti-CRISPR (Acr) proteins that can inactivate the CRISPR-Cas systems. A number of anti-CRISPR proteins have been shown to potently inhibit subgroups of CRISPR-Cas9 systems. AcrIIA1 and AcrIIA5, encoded by Listeria monocytogenes prophages and Streptococcus thermophilus, are the most prevalent among the Acr proteins targeting type II-A CRISPR-Cas systems (AcrIIA1) and potently inhibits diverse type II-A and type II-C Cas9 homologs (AcrIIA5), respectively. Here, I investigated the structural and functions of the anti-CRISPRs proteins. The AcrIIA1 structure displays its dimeric assembly with a novel two-domain architecture. AcrIIA1 exhibits structural similarity to transcriptional factors in the N-terminal domains. When overexpressed in Escherichia coli, AcrIIA1 associates with RNAs, suggesting that AcrIIA1 functions via nucleic acid recognition. AcrIIA5 reveals a novel α/β fold connected to an intrinsically disordered region (IDR). AcrIIA5 directly interacts with single-guide RNA (sgRNA)-Cas9 complex, and hinders proper association between Cas9 and sgRNA required for the nuclease activity of Cas9. Taken together, the results reveals unique structural and functional features of AcrIIA1 and AcrIIA5, suggesting its distinct mode of action and the diversity of the inhibitory mechanisms employed by Acr proteins.

CRISPR (Clustered regularly interspaced shrot palindromic repeats, 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복단위의 배열) 및 CRISPR-associated gene (Cas, CRISPR 연관 유전자) 는 외부 유전자 및 플라스미드 침입에 대한 박테리아와 고세균과 같은 원액 생물체의 면역 시스템이다. 이 방어 메커니즘을 막기 위해 박테리아 파지는 CRISPR-Cas 시스템을 비활성화 할 수 있는 Anti-CRISPR (항크리스퍼) 단백질을 진화시켰다. 다수의 항 크리스퍼 단백질은 CRISPR-Cas 시스템의 서브 그룹을 강력하게 억제하는 것으로 나타났다. 이 논문에선 Listeria monocytogenes 및 Streptococcus thermophiles 의 CRISPR-Cas9 단백질을 억제하는 anti-CRISPR AcrIIA1 및 AcrIIA5의 단백질 구조 및 작용 메커니즘을 규명하였다. AcrIIA1은 8개의 알파헬릭스와 3개의 310헬릭스로 이루어진 두개의 도메인이 이량체로 존재하며 N-말단은 Helix-turn-helix (나선-회전-나선구조), C-말단은 coiled-coil (코일-코일) 구조를 이루고 있다. AcrIIA1은 N-말단 도메인에서 전사 인자와 구조적 유사성을 보이며, 대장균 (E.col)에서 과발현시, AcrIIA1이 핵산 인식을 통해 전사 인자의 가능성을 보였다. AcrIIA5는 7개의 연속된 베타가닥에 두개의 헬릭스가 얹혀져 있는 구조로, 앞쪽 부분에 구조가 없는 20개정도의 아미노산으로 연결되어 있는 단일 구조이다. AcrIIA5는 sgRNA (단일-가이드 리보핵산)-Cas9 복합체와 직접 상호작용을 하고, Cas9을 억제시킨다. 종합하면, AcrIIA1 및 AcrIIA5는 독특한 구조적 및 기능적 특징을 나타내며, 이는 항-크리스퍼 단백질의 독특한 방식 및 억제 메커니즘의 다양성을 시사한다.