Effects of Black Raspberry on Gut Microbiota and Microbial Metabolites in Rats Fed High-Trimethylamine-N-oxide or High-Choline Diet

Abstract

복분자로 알려진 블랙라즈베리(Rubus occidentalis)는 다른 나무딸기류에 비해 폴리페놀의 함량이 높으며, 생과, 주스, 주류 등의 형태로 소비되고 있다. 블랙라즈베리의 주요 폴리페놀 중 하나인 안토시아닌은 항산화와 항염증 효과를 가진다고 알려져 심혈관질환과 같은 다양한 만성질환의 예방 및 완화 목적으로 연구되고 있다. 하지만 블랙라즈베리에 함유되어 있는 안토시아닌은 주로 배당체로 존재하며, 체내로 잘 흡수되지 않아 장내에 머물며 분해된다고 알려져 있다. 따라서 다수의 선행연구에서 보고한 블랙라즈베리 유래 파이토케미컬의 심혈관질환 완화 효과는 장내미생물의 생장환경의 변화와 그에 따른 대사물질들의 조성 변화에 기인할 것이라고 생각하였다. Trimethylamine-N-oxide(TMAO)는 해산물과 생선 등의 식품에 존재하는 물질이며, 최근 혈중 TMAO 농도가 심혈관질환의 원인이 될 수 있다는 연구가 보고되고 있다. 혈중 TMAO의 농도는 그 자체를 섭취하거나, trimethylamine(TMA)의 전구체인 콜린(choline), 레시틴(lecithin), L-카르니틴(L-carnitine), 베테인(betaine) 등을 다량 함유한 식품을 섭취할 때 증가할 수 있다고 알려져 있다. TMA의 전구체는 TMA로 전환시킬 수 있는 유전자를 보유한다고 알려진 장내미생물에 의하여 TMA로 전환되고, 간의 flavin monooxygenase 3(FMO3)에 의하여 TMAO로 산화된다. 따라서 본 연구에서는 최근 심혈관질환의 원인 물질로 지목되는 TMAO 또는 콜린을 식이에 첨가하여 TMAO의 혈중 농도를 높인 동물 모델을 이용하여 블랙라즈베리의 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향을 장내 마이크로바이옴(microbiome)과 미생물 유래 대사물질 조성 변화의 관점에서 확인하고자 하였다. 본 연구에서는 6주령의 암컷 Sprague-Dawley rat에게 고지방식이(총 열량의 45%를 지방으로 공급)와 함께 TMAO(0.15%, w/w) 또는 trimethylamine(TMA)의 전구체인 콜린(1.5%, w/w)을 식수에 첨가하여 8주간 자유 급식하였다. 블랙라즈베리 추출물은 80% 에탄올 수용액으로 추출하였고, 동결건조물의 형태로 식이에 0.6%(w/w) 첨가하였다. 정상군(CON)은 정상식이(AIN-93G)를, 대조군(HF)은 고지방식이를 제공하여 실험군과 비교하였다. 연구 1의 목적은 블랙라즈베리의 섭취가 고지방식이와 함께 고TMAO 식수를 섭취한 rat(HFT)의 심혈관질환의 위험인자인 혈중 TMAO의 농도와 지질지표, 장내미생물과 미생물 유래 대사물질의 조성 변화에 미치는 영향을 확인하고, 콜레스테롤과 담즙산의 대사에 관여하는 유전자 발현량의 변화를 분석하는 것이다. 본 연구에서 제공한 고TMAO 식이는 혈중 TMAO의 농도를 증가시켰다. 식이에 블랙라즈베리를 첨가했을 때 혈중 TMAO 농도는 HFT군과 차이가 없었다. HFT군은 HF군보다 혈중 저밀도지단백(LDL) 콜레스테롤의 농도가 높았으며, 블랙라즈베리를 함께 섭취한 군에서는 유의적으로 낮았다. 블랙라즈베리의 섭취는 unclassified Ruminococcaceae의 상대적 풍부도를 증가시켰다. TMAO와 블랙라즈베리의 섭취로 변화한 rat의 장내 미생물체로 인하여 증감할 것으로 예상되는 미생물 유래 대사물질(장내 담즙산, 혈중 담즙산, 장내 단쇄지방산, 장내 페놀성 대사물질)의 조성을 분석한 결과, TMAO의 섭취는 장내 담즙산과 장내 단쇄지방산의 조성에는 거의 영향을 미치지 않았다. 반면 식이에 따른 혈중 담즙산의 조성은 장내 담즙산보다 확연히 달랐으며, TMAO를 섭취한 군에서 muricholic acid(MCA), ursodeoxycholic acid(UDCA), tauro-ursodeoxycholic acid(TUDCA)와 같은 혈중 담즙산의 농도를 낮추는 경향을 보였다. 반면 블랙라즈베리의 섭취는 UDCA, tauro-α-muricholic acid(Tα-MCA)와 같이 FXR에 antagonist로써 작용한다고 알려진 담즙산의 농도를 증가시켰다. 또한 장내 페놀성 대사물질의 농도변화를 분석한 결과, 블랙라즈베리의 섭취는 페놀성 물질의 주요 대사물질인 hippuric acid의 장내 농도를 증가시켰다. 유전자 발현을 분석한 결과, 블랙라즈베리의 섭취로 인하여 간 조직의 CYP7A1 mRNA 발현이 증가하는 경향을 보였다. 뿐만 아니라 블랙라즈베리의 섭취는 혈중 콜레스테롤의 생합성을 조절하는 전사인자인 SREBP-2와 FXR의 mRNA 발현량과 콜레스테롤과 담즙산의 수송에 관여하는 단백질인 ABCG5와 회장 조직의 ASBT의 mRNA 발현량을 조절하는 경향을 보였다. 연구 2의 목적은 블랙라즈베리의 섭취가 고지방식이와 함께 고콜린식수를 섭취한 rat(HFC)의 심혈관질환의 위험인자인 혈중 TMAO의 농도와 지질지표, 장내미생물과 미생물 유래 대사물질의 조성 변화에 미치는 영향을 확인하고, 콜레스테롤과 담즙산의 대사에 관여하는 유전자 발현량의 변화를 분석하는 것이다. 연구 1의 결과와 마찬가지로, 본 연구에서 제공한 고콜린식이는 혈중 TMAO의 농도를 증가시켰다. 식이에 블랙라즈베리의 첨가는 연구 1의 결과와 다르게 혈중 TMAO 농도를 낮추었으며, 블랙라즈베리의 섭취가 간 조직 내 TMA를 TMAO로 전환하는 효소인 FMO3 유전자의 발현에 영향을 미치지 않음을 확인하였기 때문에, 블랙라즈베리가 장내 환경을 변화시켜 TMA 농도를 저하한 것에 기인한 것으로 추정한다. HFC군은 HF군보다 혈중 총콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 농도가 높았으며, 블랙라즈베리를 함께 섭취한 군에서는 유의적으로 낮았다. 장내미생물 분석 결과, 블랙라즈베리의 섭취는 HFC군에서 낮아진 장내미생물의 알파다양성(α-diversity)을 CON군 수준으로 회복시켰다. 콜린의 섭취는 콜린을 TMA로 전환할 수 있는 CutC(choline utilization) 유전자를 보유한다고 알려진 Adlercreutzia(Coriobacteriaceae), Allobaculum, Clostridium(Clostridiaceae), Coprococcus, Clostridium cluster XIVa의 상대적 풍부도를 증가시키는 경향을, 식이 중 블랙라즈베리의 첨가는 Adlercreutzia를 제외하고 이들 미생물의 풍부도를 낮추는 경향을 보였다. 또한 블랙라즈베리를 섭취한 군에서 HFC군보다 Bifidobacterium과 같은 유익균(probiotics)의 풍부도가 높았다. 장내 담즙산의 조성을 분석한 결과, 콜린의 섭취는 맹장 내의 주요 이차담즙산인 deoxycholic acid(DCA)의 농도를 낮추었으며, 블랙라즈베리의 섭취는 이 농도를 유의적으로 증가시켰다. 식이에 따른 혈중 담즙산의 조성을 분석한 결과, 콜린의 섭취는 β-MCA, cholic acid(CA), chenodeoxycholic acid(CDCA), UDCA와 같은 혈중 비접합 담즙산 농도를 낮추는 경향을 보였다. 반면 블랙라즈베리의 섭취는 이들을 증가시키는 경향을 보였다. 또한 이차담즙산 중 하나인 lithocholic acid(LCA)의 농도는 HFC군에서 유의적으로 높았고, 식이 중 블랙라즈베리의 첨가는 LCA를 유의적으로 낮췄다. 장내 단쇄지방산의 조성은 담즙산 조성에 비해 식이의 종류에 의해 크게 변화하지 않았다. 따라서 블랙라즈베리로 인한 장내 환경의 변화는 단쇄지방산보다 담즙산의 농도 변화를 야기한다고 생각할 수 있다. 또한 장내 페놀성 대사물질의 농도변화를 분석한 결과, 연구 1의 결과와 마찬가지로 블랙라즈베리의 섭취는 hippuric acid의 장내 농도를 증가시켰다. 콜레스테롤과 담즙산 대사 관련 유전자의 발현량을 분석한 결과, 간 조직의 CYP7A1의 발현량은 단백질 및 mRNA 수준에서 블랙라즈베리를 섭취한 군에서 섭취하지 않은 군보다 높았으며, SREBP-2의 mRNA 발현량은 낮았다. 본 연구 결과를 종합하면, 블랙라즈베리는 장내 환경의 변화와 미생물 유래 대사물질들의 조성 변화를 통하여 심혈관질환 위험인자와 관계된 지표들을 완화할 수 있음을 확인하였다. 특히 블랙라즈베리의 섭취는 콜린을 섭취한 군의 장내 TMA 농도를 낮출 수 있고, 체내 콜레스테롤의 배출을 방해한다고 알려진 TMAO의 혈중 농도를 감소시켰다. 이는 콜린을 TMA로 전환시킬 수 있는 박테리아의 상대적 풍부도의 감소에 의한 것임을 확인하였다. 반면 TMAO를 섭취한 군의 혈중 TMAO의 농도에는 블랙라즈베리의 섭취 유무가 영향을 미치지 않는 것을 확인하였지만, 장내미생물의 조성과 혈중 담즙산의 조성 변화를 통하여 섭취한 군의 혈중 LDL 콜레스테롤을 낮추는 것을 확인하였다. 장내미생물의 조성 변화를 확인한 결과, 블랙라즈베리의 섭취는 Bifidobacterium과 같은 유익균들의 생장에 도움을 주는 것을 확인하였다. 그리고 TMAO 또는 콜린의 섭취로 증가한 박테리아 중 일부(Paraeggerthella, Adlercreutzia, Clostridiaceae)는 고분자의 폴리페놀의 분해에 도움을 주어 심혈관계로의 흡수를 도와준다는 선행연구가 보고되어, 블랙라즈베리 폴리페놀 유래 저분자 물질들이 장내와 혈중에서 항산화와 항염증 효과 등을 나타낼 수 있을 것으로 추정한다. 이러한 장내 환경의 변화는 담즙산의 체내 농도에 변화를 야기하였는데, 블랙라즈베리의 섭취는 TMAO를 섭취한 군에서 혈중 담즙산 중 FXR에 antagonist로 작용한다고 알려진 담즙산들의 농도를 높였으며, 콜린을 섭취한 군에서는 장내와 혈중 담즙산 중 비접합 담즙산들의 농도를 높였다. 이러한 담즙산의 조성 변화는 CYP7A1의 발현을 증가시켜 콜레스테롤로부터 담즙산의 합성을 유도하여 체내 콜레스테롤의 배출에 기여할 것으로 생각한다. 본 연구는 혈중 TMAO 농도의 증가로 인하여 높아질 수 있는 심혈관질환 위험을 블랙라즈베리의 섭취로 완화할 수 있음과 그 기전을 확인한 연구로서, 흡수율이 낮은 고분자 폴리페놀들의 생리활성효과를 장내 미생물의 변화와 더불어 그들의 대사작용 변화의 관점에서 종합적으로 바라볼 수 있음을 시사한다.

Black raspberry (Rubus occidentalis: BR) cultivated in Korea contains relatively high amounts of polyphenols and anthocyanins compared to other Rubus fruits. Polyphenols in BR were reported to be rarely absorbed in the intestine. Despite their poor bioavailability in BR, BR has been regarded to be beneficial for cardiovascular health. Therefore, it was hypothesized that ameliorative potential of polyphenols in BR on cardiovascular disease (CVD) might be attributed to modulation of gut microbiota. Over the last decade, blood trimethylamine-N-oxide (TMAO) level has been reported to be associated with risk of CVD, leading to exploring the possibilities of dietary intervention in TMAO-induced CVD. Since TMAO can be produced from trimethylamine (TMA), a microbial metabolite generated from dietary quaternary amines, intakes of foods rich in TMA-containing compounds, such as choline, lecithin, L-carnitine, and betaine, as well as TMAO, can elevate blood TMAO level. Therefore, this study aimed to comprehensively elucidate the underlying protective mechanism of BR in elevated risk of CVD using rats fed two different exogenous sources, TMAO itself (Study 1) and choline as a TMA precursor (Study 2), combined with a high-fat diet for elevating blood TMAO level. In Study 1, we aimed to investigate the effects of BR extract on serum lipid profile, gut microbiota, and microbial metabolites in rats fed a high-fat diet with TMAO itself for elevating their blood TMAO level. Fifty female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 5 groups and raised for 8 weeks: CON, fed AIN-93G diet (16% calories from fat); HF, fed high-fat diet (45% calories from fat); HFB, fed high-fat diet with 0.6% (w/w) BR extract; HFT, fed high-fat diet with 0.15% (w/w) TMAO water; and HFTB, fed high-fat diet with 0.15% TMAO water and 0.6% BR extract. The groups fed TMAO water showed a significantly higher level of TMAO in serum than those fed plain water. The BR supplementation did not change serum TMAO level. Dietary TMAO caused increases in serum level of low-density lipoprotein-cholesterol (LDL-C), while intake of BR extract decreased its level. To investigate changes in gut microbial diversity and composition, total bacterial genomic DNA was extracted from cecal content and 16S ribosomal RNA amplicons were sequenced using Illumina Miseq Platform. α-Diversity of gut microbiota was not affected by dietary TMAO and BR extract. Genera Mucispirillum, Clostridium (Erysipelotrichaceae), and Paraeggerthella (Coriobacteriaceae) were enriched in the rats fed TMAO. The BR supplementation could also restore the relative abundances of Clostridium (Erysipelotrichaceae), unclassified S24-7, and Ruminococcaceae. As it was hypothesized that altered gut community may affect composition of microbial metabolites such as bile acids (BAs), short chain fatty acids (SCFAs), and phenolic metabolites were measured in serum (only for BAs) and cecum. Serum levels of farnesoid X receptor (FXR)-antagonistic BAs such as ursodeoxycholic acid (UDCA), tauro-α-muricholic acid (Tα-MCA), and tauro-ursodeoxycholic acid (TUDCA) increased in the TMAO-fed rats by the BR supplementation. Concentration of hippuric acid in the cecum increased in the BR-fed rats. We also examined mRNA expression of the genes involved in cholesterol and BA metabolisms in the host. Dietary BR extract tended to up/downregulate expressions of genes such as Cyp7a1, Srebf2, and Nr1h4 (involved in cholesterol and BA syntheses) and Abcg5 and Ntcp2 (involved in cholesterol and BA transports). Hepatic Fmo3 expression was not changed by any treatment. In Study 2, we aimed to investigate the effects of BR extract on serum lipid profile, gut microbiota, and microbial metabolites in rats fed a high-fat diet with excessive choline for elevating their blood TMAO level. Forty female SD rats were randomly divided into 4 groups and raised for 8 weeks: CON, fed AIN-93G diet; HF, fed 45% high-fat diet; HFC, fed high-fat diet with 1.5% (w/w) choline water; and HFCB, fed high-fat diet with 0.6% BR extract and 1.5% choline water. The HFC only showed a significantly higher level of TMAO in the serum than the other groups. The supplementation of BR extract reduced cecal level of TMA as well as serum level of TMAO. Excessive choline with a high-fat diet showed increases in serum levels of total cholesterol (TC) and LDL-C, which were restored by BR extract. Faith's phylogenetic diversity of gut microbiota was reduced in the rats fed excessive choline, while the supplementation of BR extract restored the diversity. The BR supplementation can improve enrichment of probiotics such as Bifidobacterium. On the other hand, genera Adlercreutzia (Coriobacteriaceae), Allobaculum, Clostridium (Clostridiaceae), Coprococcus, and Clostridium cluster XIVa, which are associated with TMA lyase activity, were enriched in the rats fed excessive choline, while the BR supplementation tended to reduce relative abundance of those bacteria except Adlercreutzia. Concentrations of most of BAs in cecum, including deoxycholic acid (DCA) which is one of the major secondary BAs in cecum, were reduced by choline and reverted by the BR supplementation. Dietary BR extract increased serum levels of primary unconjugated BAs. Concentration of hippuric acid increased in the cecum of the BR-fed rats. Dietary BR extract upregulated protein and mRNA expressions of hepatic Cyp7a1 and downregulated hepatic Srebf2 expression. However, protein and mRNA expressions of Fmo3 in liver were upregulated by the excessive choline but not changed by the BR extract. This study revealed the dietary effects of BR extract on changes in gut microbiota and microbial metabolites in rats fed a high-fat diet with TMAO itself (Study 1) or choline, a TMA precursor (Study 2). Collectively, these results suggest four possible cardio-protective mechanisms of BR: 1) BR extract can alter gut microbiota, affecting BA composition. In Study 1, the increased levels of farnesoid X receptor (FXR)-antagonistic BAs in serum may upregulate hepatic cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1) expression. In Study 2, the increased levels of unconjugated BAs in cecum might result in promotion of BA excretion. Thus, it could lead to regulation of cholesterol efflux and clearance; 2) In Study 2, BR supplementation can reduce relative abundance of gut bacteria having TMA lyase activity, leading to reduction in circulating TMAO level; 3) BR supplementation can improve enrichment of probiotics such as Bifidobacterium; and 4) Gut microbiota such as Coriobacteriaceae and Clostridiaceae enriched by dietary TMAO or choline might help improve bioavailability of polyphenols with high molecular weights in BR through catabolic activity of the microbiota on polyphenols. These findings can highlight the potential role of BR in prevention and alleviation of CVD in relation to TMAO.