비만 마우스에서 비타민 D의 식이 보충과 in vitro 처리가 골수유래 수지상세포의 분화와 기능에 미치는 영향

Abstract

비만은 비타민 D 결핍 및 대사 이상을 초래하며, 골수유래 수지상세포의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려졌다. 비타민 D는 수지상세포의 분화, 성숙 및 활성화에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 비타민 D 수용체 신호전달경로는 자가포식을 조절하며, 자가포식은 수지상세포의 기능적 측면과 연관이 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 본 연구는 고지방식이로 유도한 비만 마우스의 골수유래 수지상세포에서 비타민 D의 식이 보충과 in vitro 처리가 수지상세포의 분화와 기능 및 자가포식에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 10 주령 수컷 C57BL/6 마우스를 네 군으로 임의 배정한 후 지방 급원으로부터의 열량(대조식이 또는 고지방식이, CON 또는 HFD)과 비타민 D 함량(비타민 D 대조식이 또는 비타민 D 보충식이, vDC 또는 vDS)에 따른 네 가지 식이를 12주 동안 제공하여 사육하였다. 마우스의 경골과 대퇴골에서 골수유래세포를 분리한 후 rmGM-CSF (20 ng/mL)을 처리하고 7일 동안 배양하여 골수유래 수지상세포로 분화시켰다. 배양기간 동안 1,25(OH)2D3를 배지 내 최종 농도가 1 nM이 되도록 처리하였고, 배양 6일차에 LPS (50 ng/mL)를 24시간 동안 처리하여 수지상세포의 성숙을 유도하였다. 회수된 세포는 유세포 분석을 통해 CD11c, MHC class Ⅱ, CD80, CD86의 발현을 확인하였으며, 효소면역측정법을 통해 IL-12p70의 생성 수준을 확인하였다. Western blot으로 자가포식과 관련된 단백질(LC3, p62, BECLIN1, VPS34)의 발현을 측정하였으며, real-time PCR로 비타민 D 수용체의 유전자 발현을 측정하였다. 골수유래 수지상세포의 IL-12p70 분비량은 식이 비타민 D 보충군에서 보충하지 않은 군에 비해 유의하게 낮았다. 식이 비타민 D 보충 여부와 관계없이 골수유래 수지상세포의 MHC class Ⅱ, CD80, CD86의 발현과 IL-12p70의 분비량이 대조 마우스와 비만 마우스에서 모두 1,25(OH)2D3 in vitro 처리에 의해 억제되었다. 자가포식 관련 LC3Ⅱ/Ⅰ 비율과 VPS34 단백질 발현량은 LPS로 자극하지 않은 CON-vDC군에서만 1,25(OH)2D3 in vitro 처리에 의해 증가하였고, p62 단백질 발현량은 1,25(OH)2D3 in vitro 처리로 인해 감소하였다. Vdr mRNA 발현량은 LPS로 자극하지 않은 HFD-vDC군에서만 1,25(OH)2D3 in vitro 처리에 의해 유의하게 증가하였다. 결론적으로, 본 연구에서 식이 비타민 D 보충이 IL-12 분비를 억제함으로써 수지상세포의 Th1 세포 유도 기능을 약화시킬 가능성을 확인하였다. 비타민 D in vitro 처리에 따라 대조 마우스의 미성숙 수지상세포에서만 자가포식 활성이 상향 조절되었으나, 비만 마우스의 수지상세포에서는 이러한 비타민 D 처리 효과가 나타나지 않았는데, 이는 비만 마우스의 수지상세포에서 1,25(OH)2D3 in vitro 처리에 의해 감소한 Vdr 발현 때문인 것으로 사료된다.

Obesity is associated with dysregulation of vitamin D metabolism and altered immune responses in bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). Vitamin D can affect differentiation, maturation, and activation of dendritic cells (DCs) and regulate autophagy via vitamin D receptor (VDR) signaling. Autophagy, which buffers nutrient deprivation by recycling macromolecules in organisms, was recently shown to be involved in the functions of DCs. We investigated the effects of dietary vitamin D supplementation and in vitro 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) treatment on autophagy in BMDCs from control and high fat diet-induced obese mice. C57BL/6 male mice were fed control or high fat diets (CON or HFD) containing vitamin D control or supplemented diet (vDC or vDS) for 12 wks. BMDCs were generated by culturing bone marrow cells with 20 ng/mL rmGM-CSF, and were treated with 1 nM of 1,25(OH)2D3. Maturation of BMDCs was induced by LPS (50 ng/mL) stimulation for 24 h. 1,25(OH)2D3 treatment inhibited the expression of phenotypes related with DC function (MHC class Ⅱ, CD86, CD80) and production of IL-12p70 in both control and obese mice, regardless of dietary vitamin D supplementation. LC3Ⅱ/Ⅰ and VPS34 protein levels were increased, and p62 expression was decreased by in vitro 1,25(OH)2D3 treatment in CON-vDC group only. Vdr mRNA level was decreased by 1,25(OH)2D3 treatment in HFD-vDC group. In conclusion, autophagy flux was increased by 1,25(OH)2D3 treatment in CON-vDC group, but not in HFD-vDC group. This suggest that the decreased expression of Vdr by 1,25(OH)2D3 might have affected autophagy flux in obese mice.