비타민 D 보충이 고지방식이를 섭취한 비만 마우스의 CD4+ T 세포 아형과 mTOR 신호전달에 미치는 영향

Abstract

비타민 D는 CD4+ T 세포의 분화 및 세포 내 대사에 영향을 미치는 것으로 보고되었으며, 비만은 비타민 D 대사 이상과 CD4+ T 세포 아형의 불균형을 초래하는 것이 관찰되었다. mTOR 신호전달 경로는 CD4+ T 세포의 증식과 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다. 일부 연구에서 비만이나 in vitro 비타민 D 처리가 mTOR 신호전달 경로에 영향을 미치는 것이 확인되었으나, 비만마우스의 T 세포 내 mTOR 신호전달 경로에 식이 비타민 D 보충이 미치는 효과에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 없다. 이에 본 연구는 식이 비타민 D 보충이 고지방식이로 유도한 비만마우스의 CD4+ T 세포 아형과 mTOR 신호전달에 미치는 영향을 확인하는 것을 목적으로 하였다. 10 주령 수컷 C57BL/6N 마우스를 네 군으로 임의 배정한 뒤 실험 식이를 12 주간 제공하였다. 실험 식이는 식이 지방량 (대조식이 또는 고지방식이, CON 또는 HFD)과 비타민 D 함량 (비타민 D 대조식이 또는 비타민 D 보충식이, vDC 또는 vDS)에 따라 네 가지로 제공하였다. Negative selection으로 분리한 T 세포를 anti-CD3 mAb와 anti-CD28 mAb로 자극하여 48시간 동안 배양하였다. 회수된 세포에서 유세포분석을 통해 Th17 세포 비율(CD4+IL-17+ T cells)과 Treg 세포 비율(CD4+CD25+Foxp3+ T cells)을 확인하였고, mTOR 신호전달 관련 단백질(p70S6K, AKT, LC3, P62)의 발현량을 측정하였다. 또한 비타민 D 대사 관련 유전자(Vdr, Ddit4, Cyp27b1, Cyp24a1)및 포도당 대사 관련 유전자(Hif1α, Glut1)의 발현을 real-time PCR을 통해 분석하였다. Th17 세포 비율은 비타민 D 보충군에서 높았으며, HFD군에서 CON군 보다 높은 경향성이 나타났다. Treg 세포의 비율도 HFD군에서 CON군 보다 높았다. phospho-p70S6K/total-p70S6K 비율은 vDS군에서 vDC군 보다 유의적으로 낮았고, phospho-AKT/total-AKT 비율은 vDS군에서 vDC군 보다 유의적으로 높았다. 또한 비타민 D 보충군에서 Hif1α의 발현량은 낮았으며, Glut1의 발현량도 낮은 경향성이 있음을 확인하였다. 본 연구에서는 식이 비타민 D 보충에 의해 T 세포 내 mTORC1의 활성은 하향 조절되고, mTORC2의 활성은 상향 조절되는 것을 확인하였다. 또한 mTORC1이 HIF1α을 통하여 세포 내 포도당 대사를 촉진한다는 점을 고려하였을 때, 비타민 D 보충군에서 낮아진 Hif1α 및 Glut1의 발현량은 식이 비타민 D 보충에 의해 mTORC1의 활성이 하향 조절되었기 때문인 것으로 사료된다. 이러한 결과는 HIF1α가 T 세포 내 포도당 대사 조절에 비타민 D의 효과를 전달하는데 중요한 역할을 할 수 있으며, 식이 비타민 D 보충이 mTOR 신호전달 경로를 통하여 면역 항상성 유지에 기여할 수 있음을 시사한다.

Vitamin D can affect CD4+ T cells differentiation and cellular metabolism. Obesity is associated with dysregulation of vitamin D metabolism and impaired balance of CD4+ T cell subsets. mTOR pathway is known to regulate the proliferation and differentiation of CD4+ T cells. Obesity and invitro vitamin D treatment have been reported to affect the mTOR pathway, but the effect of dietary vitamin D supplementation on the mTOR pathway in obese mice T cells has not been reported. In this study, we investigated the effects of vitamin D on CD4+ T cell subsets and mTOR pathway. Ten-week-old-male C57BL/6N mice were divided into 4 groups and fed diets differing in fat (control or high-fat diet: CON or HFD) and vitamin D content (vitamin D control or vitamin D supplement diet: vDC or vDS) for 12 weeks. T cells purified by negative selection were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 mAbs and cultured for 48h. The percentage of Th17 cells (CD4+IL-17+ T cells) and Treg cells (CD4+CD25+Foxp3+ T cells) were confirmed, and the expression of proteins related to the mTOR pathway (p70S6K, AKT, LC3, P62) were measured. Also, the expression of genes related to the vitamin D metabolism (Vdr, Ddit4, Cyp27b1, Cyp24a1) and glucose metabolism (Hif1 α, Glut1) was analyzed. The percentage of Th17 was higher in vDS groups and tended to be higher in HFD groups than CON groups. The percentage of Treg was higher in HFD groups than CON groups. phospho-p70S6K/total-p70S6K ratio was lower in vDS groups than vDC groups, but phospho-AKT/total-AKT ratio was higher in vDS groups than vDC groups. The Hif1α mRNA level was lower and the Glut1 mRNA level tended to be lower in vDS groups than vDC groups. These results indicated that vitamin D supplementation down-regulated mTORC1 activity and up-regulated mTORC2 activity in T cells. Given that mTORC1 promote glucose metabolism through HIF1α, lower expression of Hif1α and Glut1 seemed to be due to the lower mTORC1 activity which was down-regulated by vitamin D supplementation. These findings suggest that the HIF1α may play an important role in vitamin D-mediated regulation of glucose metabolism in T cells and dietary vitamin D supplementation may contribute to the maintenance of immune homeostasis by regulating mTOR pathway in Tcells.