Inhibitory effects of surface-grafted polylactide-co-glycolide nanoparticles on the pro-inflammatory polarization of macrophages

Abstract

Macrophages are known to play a key role in the inflammatory response and regeneration process. M1 macrophages, which are pro-inflammatory macrophages, create an inflammatory environment and produce pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, IL-6, and IL-12. Due to these properties, the sustained expression of M1 macrophages can inhibit the wound healing process. Phosphatidylserine (PS) is a type of phospholipid present inside the cell membrane, and acts as an eat-me signal in apoptotic cells, resulting in macrophage phagocytosis and anti-inflammatory activity. In previous studies, it has been reported that PS inhibits the expression of M1 macrophages in the form of liposomes. To increase the utility of PS molecules, we considered the other vehicle to delivery. PLGA (polylactide-co-glycolide) is known to have excellent biocompatibility and biodegradability, and it has been widely used in nanoparticle fabrication. In this study, the surface of PLGA nanoparticle is modified with PS, and their biological properties are investigated. PLGA nanoparticles (PLGAnPs) containing phosphatidylcholine (PC) and PS were prepared using emulsification-solvent-evaporation (ESE) technique and classified as follows: 1) PC 100% (PCnP); 2) PS:PC = 50:50 (PSPCnP); and 3) PS 100% (PSnP). The size and distribution of PLGA nanoparticles were analyzed by a nanoparticle analyzer, and the surface charge was measured by a zeta potential analyzer. For cell experiments, mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) were used, and cytotoxicity by nanoparticles was measured after treatment with WST-8 for 12 hours. Lipopolysaccharide (LPS) was used for induction into M1 macrophages, and nanoparticles were treated with LPS to determine the degree of inhibition. Changes in cell morphology were observed with an inverted digital microscope after treatment for 12 hours. The markers representing M1 macrophages (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p40, CD86 and iNOS) were analyzed after treated with LPS for 6 hours. Whereas the M2 macrophages markers (Arg-1, YM-1, CD206) were analyzed after 12 hours of treatment. All the gene expression markers were assessed by RT-qPCR. The size of the nanoparticles was assessed about 210 nm in all groups. The zeta potential was close to 0 mV in the negative control group, PLGAnP. Meanwhile, the surface charges were below -12 mV in the PCnP, PSPCnP, and PSnP groups. None of the nanoparticles used in this study showed cytotoxicity. LPS-treated macrophages differentiated into M1 macrophages, and distinct morphological changes could be observed. In contrast, the M1-type morphological change was inhibited by PSPCnP and PSP cotreatment with LPS. TNF-α, IL-1β, and IL-6 mRNA expressions were decreased in all nanoparticle-treated groups, and in IL-12p40, only PSPCnP and PSnP were decreased. Although there were no statistically significant differences in the results of CD86 and iNOS, the PSPCnP group showed the highest tendency to inhibit the expression. Therefore, it was demonstrated that the PSPCnP group, in which PS and PC were present in the same ratio, maximally inhibits M1 differentiation of macrophages. However, there was no significant difference in the markers of M2 macrophages compared to the negative control group. The reason of these results is considered as the insufficient numbers of PS attached to PLGA during the particle generation process or insufficient numbers of particles which had interacted with cells.

대식세포는 염증반응과 재생과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 전염증성 대식세포인 M1형 세포는 염증성 환경을 조성하고, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 등과 같은 전염증성 사이토카인을 생성한다. 이러한 특성으로 인해 M1 대식세포의 지속적 발현은 상처의 치유 과정을 저해할 수 있다. 포스파티딜세린(PS)은 세포막 내부에 존재하는 인지질의 일종으로, 사멸세포에서 eat-me신호로 작용하여 대식세포의 탐식작용과 항염증 활성을 초래한다. 기존 연구에서 PS는 리포좀의 형태로 M1 대식세포의 발현을 억제하는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 PS 분자의 활용성을 높이기 위하여 뛰어난 생체적합성과 생분해성을 지닌 것으로 알려져 있는 PLGA (polylactide-co-glycolide)의 표면을 PS로 개질하여 항염증 활성을 지닌 나노입자를 제조하고 이의 생물학적 특성을 조사하였다. Single emulsification-solvent-evaporation(ESE) 기법을 활용하여 포스파티딜콜린(PC)과 PS를 함유한 PLGA 나노입자를 다음과 같이 제조하였다: 1) PC 100% (PCnP) 2) PS:PC = 50:50 (PSPCnP) 3) PS 100% (PSnP). PLGA 나노입자의 크기와 분포 정도는 나노입자 분석기로 분석하였으며, 표면 전하는 제타 전위 분석기를 통해 측정하였다. 세포실험에는 마우스 BMDM (Bone marrow-drived macrophage)을 이용하였고, 이들에 대한 나노입자의 세포독성은 12시간 처리 후 WST-8을 이용하여 측정하였다. M1 대식세포로 유도를 위해 lipopolysaccharide (LPS)를 사용하였고, 이를 억제하는 정도를 알아보기 위하여 나노입자를 LPS와 함께 처리하였다. 세포 형태의 변화는 12시간 처리 후 도립 디지털 현미경으로 관찰하였다. M1 대식세포를 나타내는 마커들 (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p40, CD86 및 iNOS)은 LPS와 함께 6시간 처리 후, M2 대식세포를 나타내는 마커들 (Arg-1, YM-1, CD206)은 12시간 처리 후 RT-qPCR을 통해 분석하였다. PLGA 나노입자의 크기는 모든 그룹에서 210 nm 정도로 균일하게 관찰되었다. 제타 전위는 음성대조군 PLGAnP에서 0 mV에 근접한 결과를 보였으며, PCnP, PSPCnP, 및 PSnP 군에서는 –12 mV 이하의 표면전하를 나타내었다. 본 연구에서 사용된 모든 나노입자에서는 세포독성이 나타나지 않았다. LPS를 처리한 대식세포는 M1 대식세포로 분화하며 뚜렷한 형태변화를 관찰할 수 있었다. 한편, LPS와 함께 PSPCnP 또는 PSnP를 처리한 군에서는 M1형 형태변화가 저해되는 것으로 나타났다. TNF-α, IL-1β, IL-6 mRNA 발현은 모든 나노입자 처리군에서 감소하였으며, IL-12p40에서는 PSPCnP, PSnP에서만 감소하였다. CD86 및 iNOS의 결과에서는 통계적으로 유의미한 차이는 보이지 않았지만, PSPCnP군이 가장 발현을 저해되는 경향이 나타났다. 따라서, PS와 PC가 같은 비율로 존재하는 PSCP 군이 대식세포의 M1 분화를 가장 잘 억제하는 것으로 판단된다. 다만 M2 대식세포의 마커에서는 음성대조군과 비교해 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 이는 입자생성 과정에서 충분한 양의 PS가 PLGA에 부착되지 않았거나 세포와 반응한 입자의 양이 부족한 등의 문제가 있는 것으로 판단된다.