Screening various active materials from metagenomic library and construction of lysis system

Abstract

이제껏 미생물로부터 유용한 물질을 탐색할 때 미생물 자체의 근본적인 성질, 즉 인공적으로 배양이 가 능한가 불가능한가가 큰 장애요소로 작용했었다. 16S mRNA를 통한 분류학적 연구를 통해서 현재 배양가 능한 미생물의 수가 전체 미생물계의 1%에 미치지 못함이 밝혀짐으로써 배양이 불가능한 미생물을 이용 할 수 있는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되었다. 그 결과 나타난 방법 중 하나가 Metagenome Library를 이용하는 것이다. 먼저 metagnome이란 미생물계에 존재하는 전체 미생물군 genome의 pool로 간단히 정의내릴 수 있다. 즉 metagenomic library 방법은 여러 효율적인 직접 DNA 추출 방법의 도움으로 다양한 장소로부터 얻어 진 샘플에서 특정 미생물의 순수배양과정 없이, 배양가능한 미생물과 배양이 불가능한 미생물의 genome 을 얻어서 이를 이용하여 DNA library를 만들고, PCR screening, hybridization screening, expression screening 등의 방법을 통해서 여러 유용한 활성 물질을 탐색하는 것이 기본 개념이다. 본 연구에서는 토양 미생물과 반추 미생물을 샘플로 하고, pUC19과 BAC(Bacterial Artificial Chromosome) vector를 이용하여 DNA library를 구축하였다. 그리고 LB agar plate에 여러 물질을 첨가 하여 amylase, cellulase, protease, lipase, catechol 2,3-dioxygenase 등과 유사한 활성을 보이는 clone을 expression screening 방법을 통해서 탐색하였다. 그 결과 토양 미생물에서 얻은 metagenome을 이용하여 만든 BAC vector 기반의 library에서 lipase, protease, catechol 2,3-dioxygenase와 유사한 활성을 가지는 clone을 찾을 수 있었다. 그리고 반추 미생물에서 얻은 metagenome을 이용하여 만든 pUC19 vector 기반의 library에서 amylase와 유사한 활성을 가지는 clone을 얻을 수 있었다. 위의 실험과 더불어 expression screening을 보완할 수 있도록 lysis system을 연구하였다. 대장균을 host로 한 library를 expression screening 방법으로 탐색할 때 가장 문제가 되는 것이 secretion이다. 대장균이 자기 내부에서 만들어지는 단백질을 거의 체외로 배출하지 않기 때문에, 우리가 원하는 물질 을 배지상에서 확인하기 위해서는 인위적으로 대장균을 분해해야만 했고, 이 과정에서 많은 시간과 비 용이 요구되어, 이의 개선책 마련이 시급한 실정이다. 그래서 인위적인 대장균 분해의 방법 대신, 대장 균이 일정한도(안정기)까지 성장하면 스스로 분해되도록 programmed cell lysis system 개발 가능성을 연구하였다. 이 system은 대장균이 안정기에 도달하면 작동하는 fic promoter, 대장균의 cytoplasmic membrane을 무력화시키는 holin을 만드는 t gene, 그리고 대장균의 peptidogylcan layer를 분해해 실질 적인 cell lysis를 유도하는 endolysin으로서의 T7 lysozyme을 만드는 gene으로 구성되어 있다. 이 system은 metagenomic library 방법을 통한 활성 물질의 탐구를 촉진할 수 있을 것이라 기대된다.